禽肉制品中单增李斯特菌的DiversiLab分型

郑 晶，唐中伟，2，陈 彬，黄晓蓉，林 杰，张体银

（1.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州　　350001；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州　　350002）

禽肉制品中单增李斯特菌的DiversiLab分型

郑 晶1，唐中伟1，2，陈 彬1，黄晓蓉1，林 杰1，张体银1

（1.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州350001；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州350002）

目的：研究从同一类食品中分离出的单增李斯特菌间的同源性关系，为预测预警保障食品安全和食源性疾病溯源提供科学依据和技术支持。方法：应用DiversiLab分型系统对2001—2010年福建出入境检验检疫局从各类禽肉制品中 分离出的25 株单增李斯特菌进行分型，其中包括：DNA提取、重复序列-聚合酶链式反应（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，rep-PCR）、微电泳芯片分离检测及数据分析。结果：DiversiLab分型中，相似系数为95%时，25 株菌被分为了6 组（G）；相似系数为97%时，25 株菌被分为11 组（P）。结论：DiversiLab分型结果较准确地揭示了25 株菌株间的亲缘性关系。基于rep-PCR的DiversiLab分型系统，是一种操作简单、分辨率高、重复性好且高效快速的基因分型方法，可作为食源性病原体检测及食源性疾病溯源的工具。

DiversiLab分型系统；单增李斯特菌；重复序列PCR；同源性分析

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）全名为单核细胞增生李斯特氏菌，在自然界中广泛分布，是一种人畜共患的病原菌，也是一种重要的食源性致病菌。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报告：有4%～8%的水产品，5%～10%的乳及乳制品，15%以上的家禽和30%以上的肉制品被该菌污染［1］。据陈玉贞等［2］报道，食品中李斯特菌的检出率为8.85%，其中生鸡肉为9.54%，生猪肉为24.85%，生羊肉为3.35%，生牛肉为14.47%，散装熟肉为6.84%，生食蔬菜为1.34%。99%的人类李斯特病被认为是因为食用了被李斯特菌污染的食品而引起的，其临床症状通常表现为脑膜炎、败血症、流产、产前感染、肠胃炎和单核细胞增多［3］。在美国每年大约2 500 例的感染是由单增李斯特菌引起的，感染率不是很高，但其死亡率可达20%［4］。其高致病性，在国内外的食品安全检测中逐渐被重视［5］，并已被WHO列为四大食源性致病菌之一［6］，成为许多国家食品卫生的必检项目。在我国，单增李斯特菌也被列为21世纪对卫生健康具有重大影响的12 种病原微生物之一［7］，被国家质检总局列为进出口食品的必检菌或监控病原菌。

在去过20多年的时间里，分子生物学得到快速发展，基于DNA序列分型的基因分型技术也得到了飞速发展。愈来愈多的分子分型技术被应用于微生物分型［8］，如多位点序列分析、脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）、扩增片段长度多态性（amplificed fragment length polymorphism，AFLP）、重复序列-聚合酶链式反应（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，rep-PCR）等。DiversiLab分型系统是基于rep-PCR进行分型的，它是一个高度集成、操作简便、快速的分型平台。研究表明DiversiLab分型系统与PFGE分型结果有良好的一致性［9-10］，相比于分型“金标准”的PFGE，它具有更高的重复性，更简便的操作流程，能够实现微生物的快速分型［11］，对监测和追溯环境及食品样品中的病原微生物具有重要意义。本研究的目的在于通过对从同一类食品中分离出的单增李斯特菌进行DiversiLab分型研究，揭示其内在联系，明确污染源，为将来的食品安全事件和食源性疾病溯源提供科学依据和技术支持。

1　　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源

2001—2010年福建出入境检验检疫局从各类禽肉制品中分离出的单增李斯特菌共有25 株。这25 株菌分别来自9 个不同的城市。来自南平的有3 株，来自兰州的有7 株，来自哈尔滨的有6 株，来自北京的有4 株，来自桂林、重庆、昆明、成都和西宁的各有1 株。

1.1.2试剂

李斯特菌显色培养基郑州博赛生物技术股份有限公司；胰酪胨冻大豆酵母琼脂广东环凯微生物科技有限公司；脑心浸液培养基北京陆桥科技有限公司；DNA提取试剂盒（MO BIO UltraCleanTMMicrobial DNA Isoalation Kit）、革兰氏阳性菌鉴定卡（GP）、DNA Reagents & Supplies、Diversilab Listeria Kit、DNA Chips法国生物梅里埃公司；AmpliTaq DNA聚合酶美国Applied Biosystems公司。

1.1.3仪器与设备

DiversiLab分型系统、VITEK 2 Compact 30全自动微生物鉴定仪法国生物梅里埃公司；ABI 9700聚合酶链式反应扩增仪美国Applied Biosystems公司；核酸蛋白测定仪德国Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1菌株的鉴定

2001—2010年福建出入境检验检疫局从各类禽肉制品中分离出的25 株单增李斯特菌，全部按照GB 4789.30—2010《食品微生物学检验》方法鉴定为单增李斯特菌后，在VITEK 2 Compact上用GP卡进行鉴定，确定其为单增李斯特菌（表1）。

表1　25 株单增李斯特菌菌株信息详情Taabbllee 11 　　SSppeecciiffi i cc iinnffoorrmmaattiioonn aabboouutt 2255 ssttrraaiinnss ooff L. monocytogeenneess

1.2.2DNA指纹图谱分型方法

1.2.2.1DNA的提取

实验菌株接种到胰酪胨冻大豆酵母琼脂上，在（36±1）℃条件下，培养24 h后。用DNA提取试剂盒，按照DiversiLab推荐的操作步骤进行DNA提取，用核酸蛋白测定仪将所有样品的质量浓度调整到25～40 μg/μL。

1.2.2.2PCR扩增

应用DiversiLab Listeria Kit提供的rep-PCR引物进行扩增，反应体系为25 μL：18 μL rep-PCR MM1，2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL Primer Mix L，0.5 μL Ampli Taq，2.0 μL反应模板。PCR循环条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，35 个循环，最后70 ℃延伸3 min。

1.2.2.3芯片电泳

按照DiversiLab分型步骤，先配制Gel-dye混合物，然后将Gel-dye、DNA Marker、Ladder和PCR扩增产物加载到DNA Chip，最后将加载好的芯片放入Agilent 2100运行。运行后的数据自动上传至DiversiLab网站。

1.2.2.4分型方法

采用DiversiLab软件（版本3.4.4）进行分析，用Pearson's Correlation方法来确定距离矩阵、非加权配对算术平均法建立树状图和相似矩阵，进行聚类分析。

对于流行病爆发调查常使用的PFGE分型，已经提出了一组定义菌株关系的指导标准［12］，将菌株间的关系分为：不存在差异、相关以及不同。DiversiLab分型在基于比较rep-PCR和脉冲场凝胶电泳或其他金标准方法的基础上，将相似度在97%以上的定义为样品不可区分，即两个样品之间没有带型差异，模拟电泳条带没有强度和单个差异，但整体带型强度差异可能有；将相似度在95%及以上的定义为样品具有相关性，即样品模拟电泳条带有1～2 条不同；将相似度在95%以下定义为不同样品，即样品模拟电泳图有3 条以上的条带不同［13-15］。

2　　结果与分析

相似度线：97%。图 1　　25 株单增李斯特菌的DiversiLab聚类分析图Fig.1　　Dendrogam analysis and virtual gel images of 25 strains of L. monocytogenes

采用DiversiLab分析软件进行聚类分析，得到聚类分析图，如图1所示。“P”表示相似度为97%及以上的样品分组，25 株菌被分为11 组（P），P1、P4、P6、P7、P8和P9组中各包含有2 株菌，P11组中有9 株菌，这些组内的菌株其模拟电泳条带没有差别，在遗传水平不可区分；“G”表示相似度为95%及以上的样品分组，共分为了6 组，G1组内有4 株菌，G2组内有3 株菌，G3组内有6 株菌，G4组内有2 株菌，G6组内有9 株菌，G5组内只有1 株菌，这6 组内样品间的模拟电泳条带有1～2 条不同，在遗传水平上具有相关性。

3　　讨 论

食品安全是一全球性问题，由食源性致病菌引起的食品安全问题日益突出，为有效地预防食品安全事件的发生，应对分离出的致病菌进行分型溯源。通常，来自不同区域或不同样品的同种细菌，表现出的多样性足以被分为不同的亚型。菌株分型的目的在于回答这样一个问题，即被鉴定为同一种的两个微生物菌株在遗传水平上是否相同，是否具有同源性。

随着分子生物学技术的快速发展，产生了各种基于不同原理的分型技术。如：PFGE、限制性长度多态性研究、AFLP、rep-PCR等，这些分子分型方法都有各自的局限性［16-18］。被业界公认的分型“金标准”PFGE，也很难解决类似尺度的条带以及多个实验室间重复性问题［19］。自动化的DiversiLab分型是基于rep-PCR进行分型的，它有效地解决了非自动化的rep-PCR分型方法实验室间重复性较低，分型时间较长及基于琼脂凝胶电泳的分离和检测都很难达到统一标准的问题。DiversiLab分型方法是一种自动化标准化系统，其结果的收集和处理不受主观限制，从DNA提取到出分析结果不到24 h，结果具有很高的分辨率，一般条带能达到10 条左右；标准化的试剂，重复性好，操作简单，是一种实时定量检测［20-22］。

本实验从同一类样品中分离出的25 株单增李斯特菌，在相似系数为95%时，被分为G1、G2、G3、G4、G5和G6共6 组；在相似系数为97%时，被分为P1～P11共11 组。P组内的菌株不可区分，在模拟电泳条带上没有强度和单个差异，但可能有整体带型强度差异。G组内的菌株具有相关性，在模拟电泳图上有3 条以上的条带不同。相似系数大于95%且小于97%的菌株之间具有相关性，这可能是来自同一污染源的菌株发生了变异，在分型上没有表现出同一性。来自同一地方同一商场的L095 与L096、L099与L102不可区分，并且是来自同一类型同一性状的食品，表明他们是来自同一污染源。P11组内的9 株菌，有来自同一地方同一商场的，也有来自同一地方不同商场的，还有来自不同地方不同商场的，这些菌株之间不可区分，表明该型的单增李斯特菌株具有流行性，从一个地方传播到了另外一个地方，这些食品在不同或相同的地方通过不同或相同的途径污染了相同的单增李斯特菌菌株。

要对食品中分离出的致病菌进行准确的溯源，需要结合多种信息，如：采样地、生产企业、生产日期、生产批号、物流信息、原材料来源地、菌株分离时间及菌株本身的生理生化特征等多种信息才能准确地得出结论。刘静宇等［23-24］对食品中分离的金黄色葡萄球菌的分型研究表明，DiversiLab分型结果与样品的种类、来源及菌株分离时间等信息间有较合理的对应关系和内在联系，结果准确可靠。本研究中，DiversiLab的分型结果揭示出了菌株之间的亲缘性关系，对实现单增李斯特菌的主动监测和传染源溯源具有指导作用，对控制由单增李斯特菌引起的食源性疾病流行具有十分重要的意义。

自动化的DiversiLab分型系统具有诸多优点，但也有局限性［25］：在进行芯片分析检测时，只需1 μL样品，如果操作不小心，产生了气泡，对结果有严重影响，需重新分析，增加了检测成本和检测时间；此外，若样本不足12 个，为形成回路芯片上剩余的孔也必须加入Marker和样品替代物使其保持与加样孔的体积一致，造成试剂浪费和成本增加。然而，DiversiLab分型系统的高效率、高分辨率、能建立数据库的可重复性、实验室间能比较和高通量的应用以及其基于Web界面的远程访问和数据库共享等优点完全能应用于菌株跟踪监测，疾病爆发病源调查及食源性致病菌的溯源分析。在日常的菌株跟踪监测和疾病爆发病原调查中自动化的DiversiLab分型工具将是一种十分有用的工具。

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DiversiLab Typing of Listeria monocytogenes Isolated from Poultry Products

ZHENG Jing1， TANG Zhongwei1，2， CHEN Bin1， HUANG Xiaorong1， LIN Jie1， ZHANG Tiyin1
（1. Fujian Province Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research， Fuzhou350001， China；2. College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou350002， China）

To study the homologous relationship of Listeria monocytogenes strains isolated from poultry products， which can provide a scientifi c basis for forecasting and early warning of food security and provide technical support for preventing food-borne diseases caused by L. monocytogenes. Methods： A total of 25 strains of L. monocytogenes isolated from the poultry products in the Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau from 2001 to 2010 were typed by DiversiLab typing system through DNA extraction， repetitive sequence-based polymerase chain reaction （rep-PCR）， and microfl uidic chip. Results： At the similarity coefficient of 95% and 97%， 25 strains were accordingly divided into 6 groups （G） and 11 patterns （P）， respectively. Conclusions： The genetic relatedness among the 25 strains could be accurately revealed by DiversiLab typing. Automated DiversiLab typing system is a fast， easily operated， highly discriminatory and effi cient genetyping method. It can be recommended as an epidemiological analysis tool for foodborne illness.

DiversiLab typing system； Listeria monocytogenes； rep-PCR； epidemiological analysis

Q936

A

1002-6630（2015）24-0220-04

10.7506/spkx1002-6630-201524041

2015-06-27

福建省自然科学基金项目（2010J01266）；国家质检总局科技计划项目（2010IK169）

郑晶（1973—），女，研究员，本科，研究方向为食品中微生物检测。E-mail：fjciqzj@qq.com