响应面试验优化广昌白莲蛋白提取工艺及其酶解多肽抗氧化活性

饶胜其，臧祥玉，濮瑜雯，杨振泉，方维明（扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州　225127）

响应面试验优化广昌白莲蛋白提取工艺及其酶解多肽抗氧化活性

饶胜其，臧祥玉，濮瑜雯，杨振泉，方维明*
（扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州225127）

以广昌白莲为原料，通过单因素试验和响应面试验优化超声波辅助提取白莲蛋白的工艺，并采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶对白莲蛋白进行单酶和有次序双酶水解，研究其酶解产物的抗氧化活性。结果表明，广昌白莲蛋白的最佳提取条件为：在超声功率固定250 W条件下，料液比1∶14（g/mL）、提取温度35.5 ℃、提取时间58 min、NaCl浓度0.14 mol/L。所得蛋白提取率达到89.86%，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacryl amide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析显示其分子质量主要分布在14～25 kD和35～60 kD之间；不同酶解方式显著影响了白莲蛋白的酶解效果及其酶解产物的抗氧化活性，其中先胃蛋白酶后碱性蛋白酶的双酶酶解为最佳方式，其蛋白水解度达到20%，其酶解产物（P-A）H的总还原能力（A700 nm）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和·OH清除能力IC50值分别达到1.002、0.379 mg/mL和1.093 mg/mL，表明广昌白莲蛋白酶解产物具有较强的抗氧化活性。

广昌白莲；提取；酶解；抗氧化活性

莲子是一种水生经济作物，在中国种植的历史已经有3 000多年［1］。目前，莲花在亚洲、大洋洲、美洲被广泛种植和消费［2］。传统上，莲子被用作可食性的蔬菜和草药［3］。有报道称，莲子具有丰富功能性化合物，包括糖类、多酚类、黄酮醇类、花青素类、生物碱类等。这些生物活性物质都具备药理活性，比如抗肥胖、抗癌、消炎及心血管疾病等［4-5］。通过对广昌白莲干白莲莲子中蛋白的组成、溶性和品质进行研究，发现其蛋白含量为23.94%，其氨基酸组成中必需氨基酸的比例符合世界卫生组织规定的要求，盐溶和水溶性蛋白占总蛋白量的76.23%，醇溶蛋白仅占0.33%［6］。

目前，对广昌白莲的研究仅限于加工、选育、成分分析等［7］，对其功能成分的研究多集中于莲子多酚［8］、莲子多糖［9］等，对蛋白研究则局限于莲子蛋白的优化提取［10］、氨基酸种类［11］，而对蛋白降解后新功能的报道极少。张羽［12］对莲子蛋白的组成及其分子特性进行了研究，运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）、等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳分析得到莲子水溶蛋白的10 个亚基分子质量分布在69.4～87 kD之间；盐溶蛋白10 个亚基分子质量分布在14.2～110 kD之间；酸溶蛋白的12 个亚基分子质量分布在7.2～97.3 kD之间；碱溶蛋白6 个亚基分子质量分布在15.0～46 kD之间；并且研究发现莲子的4 种主要蛋白组分对·OH具有较好的清除作用。这说明莲子蛋白分子中存在着具有抗氧化能力的氨基酸片段，可以通过酶解的方式对莲子蛋白进行水解，释放出莲子蛋白中具有抗氧化性能的多肽片段，增强莲子蛋白的功能特性。

目前有关抗氧化肽的研究主要集中在抗氧化肽的酶解制备、分离、鉴定以及酶解产物或抗氧化肽的体内外生物活性研究。尽管部分高纯抗氧化肽被证实具有强效的抗氧化活性，但其分离纯化过程一般较繁琐，成本较高。相对于纯肽，高活性蛋白水解母液或粗分离组分从产品开发方面更具有可行性［13］。本研究以江西省广昌白莲为原料，对莲子蛋白的提取工艺在单因素试验的基础上运用响应面试验设计方法进行了优化，得到了高含量的莲子蛋白，并对所提取的莲子蛋白分别用胃蛋白酶和碱性蛋白酶进行了单酶和双酶复合水解，对其水解产物的抗氧化能力进行了考察，为高抗氧化活性蛋白酶解液产品的开发提供数据参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

广昌白莲鹰潭市龙虎山百佳食品有限公司；碱性蛋白酶（＞10万 U/g）上海蓝季科技发展有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g）国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美国Sigma公司；考马斯亮蓝G250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、邻苯二甲醛（O-phthaldialdehyde，OPA）生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、水杨酸、过氧化氢、铁氰化钾等均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

UV-7504紫外-可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司；pico17微量台式离心机美国Thermo公司；5804R型高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；KQ-400KDE超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；DYY-10C型电泳仪北京市六一仪器厂；高速万能粉碎机天津四泰斯特仪器有限公司；超级恒温水浴锅国华仪器有限公司；冻干机美国Thermo公司。

1.3方法

1.3.1广昌白莲蛋白的提取

参考王亚举等［14］的方法，并做适当调整：首先将市售白莲于37 ℃干燥10 h，粉碎，过60目金属筛，制成莲子粉。称取适量的莲子粉，按一定料液比在一定温度条件下超声（固定超声功率250 W）提取一定时间后，8 000 r/min离心15 min，收集上清液，测定蛋白含量并计算提取率。在最优蛋白提取工艺条件下，放大蛋白提取体系至1 L，调节上清液pH值至莲子蛋白等电点，静止0.5 h，4 000 r/min离心15 min，取沉淀物用95%乙醇溶液洗2 次，蒸馏水洗至中性，冷冻干燥备用。按下式计算提取率。

1.3.2蛋白提取条件的单因素试验设计

选定料液比、提取时间、提取温度、NaCl浓度4 个因素做单因素试验，考察各因素对提取效果的影响，选取最优单因素条件。

1.3.3蛋白提取条件的响应面试验设计

在单因素试验的基础上，采用Design-Export 8.0的Box-Behnken试验设计响应面试验，每个组合重复3 次，因素和水平见表1。

表1　响应面试验因素水平Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface methodology

1.3.4蛋白酶解液的制备

水解条件参考饶胜其等［15］的研究，稍作修改，水解步骤如下：取2 g莲子蛋白粉，加适量缓冲溶液搅拌至蛋白溶解，沸水浴10 min使蛋白变性利于后期酶解，降温到所需温度，分别采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶进行单酶水解以及采用胃蛋白酶与碱性蛋白酶按不同顺序进行分步水解，反应体系为100 mL，水解条件按表2方式进行。待酶解反应完毕后，95 ℃保温10 min以终止酶反应。整个酶解过程在酶反应器中进行，且通过酸碱滴定控制pH值。将所有最终水解液的pH值调节至7.5，并于4 ℃、8 000 r/min转速条件下离心15 min，收集上清液，－20 ℃冻存，以待分析。

表2　单酶及双酶分步酶解条件Table 2 The conditions for single and dual enzymatic hydrolysis

1.3.5蛋白含量测定

广昌白莲总蛋白含量的测定采用常量凯氏定氮法，参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白的测定》。广昌白莲提取液蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，标准曲线方程为Y=0.004 4X+0.228 7，R2=0.987 3。蛋白提取效果采用12% SDS-PAGE进行分析。

1.3.6蛋白酶解液分析

水解度采用甲醛滴定法［16］进行测定；多肽质量浓度采用OPA法［17］进行测定，以胰蛋白胨为标准品，标准曲线方程为Y=0.408X+0.141 1，R2=0.978 9；总还原能力采用Fe3+还原法［18］测定，样品多肽质量浓度统一稀释至0.2 mg/mL，以A700 nm值表示总还原力；DPPH自由基清除活性参考Shimada等［19］的方法测定，以IC50值表示，即清除50% DPPH自由基时所对应的多肽质量浓度；·OH清除活性参考Guo Zhanyong等［20］的方法测定，以IC50值表示，即清除50%·OH时所对应的多肽质量浓度。

1.4数据统计

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，用Duncan's多重分析进行组间显著性检验，显著水平为P＜0.05。

2　结果与分析

2.1广昌白莲蛋白提取的单因素试验结果

2.1.1料液比对蛋白提取率的影响

NaCl溶液浓度0.2 mol/L，在35 ℃条件下分别以料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20对莲子蛋白超声提取60 min，离心取上清液测定蛋白含量。由图1可知，莲子蛋白提取率随着溶剂用量的增大呈先急剧升高后缓慢下降的趋势，在料液比1∶12时达到最高，故采用料液比1∶12进行后续试验。

图 1　料液比对蛋白提取率的影响Fig.1　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of lotus seed protein

2.1.2提取时间对蛋白提取率的影响

图 2　提取时间对蛋白提取率的影响Fig.2　Effect of extraction time on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、NaCl溶液浓度0.2 mol/L，在35℃条件下分别超声波提取15、30、45、60、90、120 min，离心取上清液测定蛋白含量。由图2可知，在15～30 min莲子蛋白提取率随着提取时间的延长迅速上升，在30～60 min基本趋于稳定，在45 min时达到最大值，但在超过60 min后提取率逐渐下降，可能是提取时间过长导致部分蛋白变性沉淀，故选用提取时间45 min进行后续试验。

2.1.3提取温度对蛋白提取率的影响

图 3　提取温度对蛋白提取率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、NaCl溶液浓度0.2 mol/L，分别在25、30、35、40、45 ℃条件下超声波提取45 min，离心取上清液测定蛋白含量。由图3可知，莲子蛋白提取率随着温度的升高呈先升高后下降的趋势，在35 ℃时达到最高，35 ℃之后随着温度的升高提取率反而下降，其原因可能是温度过高引起蛋白变性，溶解性减弱，故选用提取温度35 ℃进行后续试验。

2.1.4NaCl浓度对蛋白提取率的影响

图 4　NaCl浓度对蛋白提取率的影响Fig.4　Effect of NaCl concentration on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、提取时间45 min，在35 ℃条件下分别以0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L NaCl溶液对莲子蛋白进行超声波提取，离心取上清液测定蛋白含量。由图4可知，莲子蛋白提取率随着盐浓度的升高呈先升高后下降的趋势，在0.15 mol/L时达到最高，这可能是因为低浓度的盐溶液中盐溶作用促进了蛋白的溶解，而高浓度盐溶液中盐析作用降低了蛋白溶解度，故选用浓度为0.15 mol/L的NaCl溶液进行蛋白的提取。

2.2广昌白莲蛋白提取的响应面优化试验结果

2.2.1响应面试验设计及结果

表3　响应面优化莲子蛋白提取工艺试验设计与结果Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of lotus seed protein

以单因素试验结果为基础，根据Box-Behnken设计原理，以料液比、提取时间、提取温度、NaCl浓度为自变量，蛋白提取率Y为响应值，设计四因素三水平共29 个试验点的响应面试验，试验设计及结果见表3。

2.2.2模型建立及显著性分析

应用Box-Behnken对试验结果进行方差分析见表4及模拟多元响应面回归模型，得出的方程为：

表4　回归模型方差分析表Table 4　Analysis of variance of regression model

由表4得出，模型的P＜0.01，模型达到极显著。模型失拟项P＞0.05，不显著，表示模型预测值与实际误差值较小，可以用此模型来预测真实值。模型的的绝对系数R2=0.993 1，说明该模型能解释99.31%的响应值变化，因此该模型拟合程度较好，试验误差小，与实际情况吻合，可以用此模型对蛋白提取效果进行分析和预测。各因素的影响大小为提取时间＞料液比＞提取温度＞NaCl浓度，所有二次项和交互项X1X2、X1X3、X1X4对蛋白提取率有显著影响。

2.2.3蛋白提取工艺的响应面分析

图 5　各因素交互作用对蛋白提取率影响的响应面图Fig.5　Response surface contour plots showing the interactive effects of various factors on the extraction yield of lotus seed protein

由图5A可知，随着料液比和提取时间水平的增加，响应值均先增加后减小，在中心点附近提取率最高；由图5B可知，随着料液比和提取温度水平的增加，响应值先增加后减小，在中心点有最大提取率；由图5C可知，随着料液比和NaCl浓度水平的增加，响应值不断增加，超过中心点后逐渐趋于稳定；由图5D可知，随着提取时间的延长，响应值增大，超过中心点后，趋于稳定，而随着提取温度的升高，提取率先增加后减小；由图5E可知，随着提取时间的延长，响应值不断增加，超过中心点，趋于稳定，随着NaCl浓度增加，响应值先增加后减小；由图5F可知，随着提取温度和NaCl浓度水平的增加，响应值均先增加后减小，在中心点有最大提取率。由以上分析可知，在各因素中心点附近，蛋白具有最高提取率，回归方程具有最优水平。

2.2.4最佳提取条件的确定和验证

将回归方程对X1、X2、X3、X4分别取一阶偏导数等于零，解方程组得出最优提取条件为料液比1∶14.12、提取温度35.64 ℃、提取时间57.71 min、NaCl浓度0.14 mol/L，计算蛋白提取率为91.74%，但从实验的可行性考虑，将最优工艺参数调整为：料液比1∶14、提取温度35.5 ℃、提取时间58 min、NaCl浓度0.14 mol/L。为了验证响应面法所得结果的准确性，重复实验3 次，所得蛋白提取率为89.86%，实验结果与模型理论值非常接近，且重复实验相对偏差不超过5%。

2.3广昌白莲蛋白的酶解液分析

抗氧化肽的构效关系研究表明，肽段内部和末端的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸能显著增强抗氧化肽的活性。例如，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、His、Tyr、Trp和Cys等氨基酸。疏水性氨基酸（如Ala、Val、Leu）的脂肪烃侧链能使抗氧化肽与多不饱和脂肪酸的相互作用增强，或使其易于与自由基结合，从而抑制脂质过氧化反应［21］。芳香族氨基酸Trp、Tyr可通过供氢发挥抗氧化作用［22］。据报道，胃蛋白酶和碱性蛋白酶作用蛋白底物均易于产生末端为疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的肽段［23-25］。许多研究也证实胃蛋白酶和碱性蛋白酶及其复合作用对蛋白原料中的高活性功能肽的释放具有显著效果［15，26-28］。因此，本研究选用胃蛋白酶和碱性蛋白酶分别对莲子蛋白分别进行单酶和有次序双酶酶解，并考察所致蛋白酶解产物的抗氧化活性。

2.3.1不同酶解方式对蛋白水解度的影响

图 6　蛋白水解度（A）和蛋白水解效果的电泳分析（BB）Fig.6　Hydrolysis degree （A） and SDS-PAGE analysis of the effectiveness of enzymatic hydrolysis （B） of lotus seed protein

由图6A可知，双酶分步水解作用下莲子蛋白的水解度显著高于单酶作用；双酶水解的先后顺序也显著影响了莲子蛋白水解度；在4 种不同的水解液中，胃蛋白酶-碱性蛋白酶作用下莲子蛋白的水解度显著高于其他三者。其原因是，所用碱性蛋白酶和胃蛋白酶的酶作用位点不同，对底物蛋白的水解能够互为补充，故双酶酶解效果高于单酶；在双酶酶解中，第一步酶解产生的肽段及未水解完全的蛋白即成为第二步酶解的底物，而莲子中的不同种类蛋白对两种蛋白酶的敏感程度有差异，故水解次序肯定会影响最终产物的肽段组成。图6B电泳结果显示，在最优提取工艺条件下，所提粗蛋白溶液及其酸沉冻干后的蛋白粉的蛋白分子质量分布与莲子原料中的蛋白基本保持一致，主要在14～25 kD和35～60 kD范围内（泳道1～3）；基于莲子冻干蛋白粉的蛋白含量检测结果，换算得出该提取蛋白样品中的蛋白纯度达到92%，表明该提取工艺优良。胃蛋白酶水解液PH中依然保留有高含量的较高分子质量蛋白（约10～30 kD），进一步佐证了其作用下莲子蛋白的低度水解，水解度仅为7.78%；双酶酶解液中的高分子蛋白条带数量及比例显著低于单酶酶解液，许多研究报道显示高活性抗氧化肽的分子质量一般低于3 kD，因此，本研究中从蛋白利用率及抗氧化肽分子质量层面考虑，应该选用双酶对莲子蛋白进行酶解。

2.3.2广昌白莲蛋白酶解液的抗氧化活性

图 7　莲子蛋白酶解液的总还原力（A）、DPPH自由基清除活性（BB）和·OH清除活性（CC）Fig.7　Total reducing power （A）， DPPH radical scavenging activity （B） and hydroxyl radical scavenging activity （C） of lotus seed protein hydrolysate

由图7可知，当酶解液质量浓度为1.0 mg/mL时，4 种水解液的还原能力在0.65～1.02之间，大小顺序为（P-A）H＞（A-P）H＞AH＞PH，其中水解液PH的还原能力显著弱于其他3 种水解液（图7A）；4 种水解液的DPPH自由基清除能力大小顺序为（A-P）H＞PH＞（P-A）H＞AH，其中水解液PH和（A-P）H较强，其IC50值分别为0.162 mg/mL和0.146 mg/mL（图7B）；4 种水解液的·OH清除能力大小顺序为（P-A）H＞AH＞（A-P）H＞PH，其中水解液AH和（P-A）H显著高于其他两种水解液，其IC50值分别达到1.396 mg/mL和1.093 mg/mL（图7C）。综合图7可知，莲子蛋白的4 种酶解液的总还原能力、DPPH自由基清除活性和·OH清除活性并没有呈现严格的一一对应关系，原因是所选3 种抗氧化指标的反应原理不同，所反映的抗氧化活性与酶解液中的肽段组成具有重要关系。尽管如此，在莲子蛋白的4 种酶解液中，酶解液（P-A）H的总还原能力和·OH清除能力最强，且其DPPH自由基清除活性也处于中等水平。此外，4 种酶解方式中，先胃蛋白酶后碱性蛋白酶作用下莲子蛋白的水解度显著高于其他三者，达到20%（图6A），表明这种酶解方式对莲子蛋白的利用率最高。综上所述，选用胃蛋白酶和碱性蛋白酶依次分步酶解作为莲子蛋白抗氧化肽制备的最佳用酶及酶解方式。

33　结 论

通过单因素试验及响应面优化，确定广昌白莲蛋白最佳提取条件为：在超声功率固定250 W条件下，料液比1∶14（g/mL）、提取温度35.5 ℃、提取时间58 min、

NaCl浓度0.14 mol/L。所得蛋白提取率达到89.86%；所提蛋白分子质量分布与莲子原料中的蛋白基本保持一致，主要在14～25 kD和35～60 kD范围内；蛋白提取影响因素大小为：提取时间＞料液比＞提取温度＞NaCl浓度。经过热变性处理的莲子提纯蛋白，分别采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶对蛋白进行单酶和有次序的双酶酶解，结果表明：先胃蛋白酶后碱性蛋白酶处理条件下的莲子蛋白酶解产物（P-A）H具有最高水解度和较高抗氧化活性，其水解度达到20%，其总还原能力（A700 nm）、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的IC50值分别达到1.002、0.379 mg/mL和1.093 mg/mL。

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Optimization of Extraction Conditions of Guangchang White Lotus Seed Protein by Response Surface Methodology and Antioxidant Activities of Its Enzymatic Hydrolysates

RAO Shengqi， ZANG Xiangyu， PU Yuwen， YANG Zhenquan， FANG Weiming*
（School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou2 25127， China）

The conditions for ultrasonic-assisted extraction of protein from Guangchang while lotus seed were optimized by single factor experiments and response surface methodology. The extracted proteins were hydrolyzed using alcalase and pepsi singly or in sequential combinations， and antioxidant activities of the resulting hydrolysates were analyzed. The results suggested that the optimum conditions under a fi xed ultrasonic power of 250 W for extracting protein from Guangchang white lotus seed were determined as follows: solid/solvent ratio， 1:14； extraction temperature， 35.5 ℃； extraction time，58 min； and NaCl concentration， 0.14 mol/L. Under these conditions， the extraction yield of protein was 89.86%. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed that molecular weights of the extracted proteins were mainly in the range of 14-25 kD and 35-60 kD. Different treatments with pepsin and/or alcalase signifi cantly infl uenced the effectiveness of enzymatic hydrolysis of lotus seed protein and antioxidant activities of hydrolysates， and sequential treatment with pepsin followed by alcalase was the best one. Under this treatment， the degree of hydrolysis was 20%， and the total reduce power （A700 nm）， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical scavenging activity （IC50）and hydroxyl radical scavenging activity （IC50） of the hydrolysate （P-A）H were 1.002， 0.379 mg/mL and 1.093 mg/mL，respectively， demonstrating that the enzymatic hydrolysate had potent antioxidant activity.

Guangchang white lotus； extraction； enzymat ic hydrolysis； antioxidant activity

TS262.5

A

1002-6630（2015）24-0063-07

10.7506/spkx1002-6630-201524011

2015-06-30

江苏省自然科学基金青年科学基金项目（B K20140479）；江苏省高校自然科学研究项目（12KJD550007；15KJA550004）；江苏高校优势学科建设工程资助项目

饶胜其（1981—），男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术及食品资源综合利用。E-mail：sqrao@yzu.edu.cn

方维明（1965—），男，教授，博士，研究方向为农产品深加工及食品生物技术。E-mail：wmfang@yzu.edu.cn