海洋内生放线菌fang-1的次生代谢产物研究

毕淑峰，朱广琪，吕永展

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山245041）

放线菌是一类能产生多种类型活性成分的革兰氏阳性菌，在已发现的活性次生代谢产物中很多都是放线菌产生的[1]。从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量锐减，于是人们把目光投向了更为广阔的生境—占地球面积的70%的海洋[2]。海洋高盐度、高压等特点使海洋微生物形成独特的代谢途径，近年已从海洋放线菌中分到了很多结构新颖、活性好的新化合物。本实验对海洋内生放线菌fang-1 次生代谢产物进行研究，得到6 个化合物，并对其结构进行了鉴定，均为首次从该放线菌中分离得到。

1 主要仪器与试剂

Bruker DRX-500 型超导核磁共振仪 （德国Bruker 公司），高效液相色谱[UV detector L-7400和Apollo C18-5 μm，Hitachi pump L-7100，日本日立公司]，SW-CJ-2FD 双人单面净化工作台（苏州市华宇净化设备有限公司），Agilent6210 TOF LC/MS 液质联用仪 （美国Agilent 公司），大孔树脂XAD-7（美国Amberlite 公司），旋转蒸发仪EYELA N-1000，（东京理化器械株式会社），TH-3560 立式高压灭菌锅[造鑫(鑫科) 企业有限公司]，Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia 生物科技公司）。

氘代试剂均由美国Merk 公司生产，HPLC 色谱纯试剂由美国天地试剂公司生产，其他甲醇、乙酸乙酯、氯仿等均是国产分析纯。

2 菌株发酵

将fang-1 菌种接种于约装有0.4L 培养基的1 L 锥形瓶中，培养基的主要成分为蛋白胨、蔗糖和酵母膏。在28±1℃温度下震荡培养48h，将种子培养液接种到约装有0.4L 培养基（主要成分为蛋白胨、蔗糖和酵母膏）的1L 锥形瓶中发酵培养，一周后收集发酵液，并离心除去固体菌丝体，得到约50L 深褐色发酵液。

3 提取与分离

每0.5L 发酵液中加入20.0g 大孔树脂，分装于1L 锥形瓶中，在摇床上震摇3h，使大孔树脂吸附发酵液中的次生代谢产物。将大孔树脂装于玻璃柱中，用蒸馏水冲洗大孔树脂至流出液无色。再用甲醇洗脱大孔树脂至洗脱液无色，在旋转蒸发仪上减压浓缩甲醇，最终得4.2g 黑褐色的粗浸膏。用20 mL 蒸馏水将粗浸膏超声分散，使其成为均匀的颗粒状悬浮液，然后依次用不同极性有机溶剂（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）分别震荡萃取5 次，在旋转蒸发仪上减压浓缩各种极性的萃取液，得不同极性的粗浸膏。运用硅胶和凝胶柱层析、重结晶、HPLC等方法反复分离纯化乙酸乙酯粗浸膏，得单体化合物1-6。

4 结构鉴定

化合物1：白色粉末。ESI-MS m/z:311[M+H]+，333 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:9.24(1H，br s，OH-7')，7.88(2H，br s，NH)，7.27(2H，t，J=7.5Hz，H-6，8)，7.20 (1H，d，J=6.9Hz，H-7)，7.03(2H，d，J=7.5 Hz，H-5，9)，6.83(2H，d，J=8.0 Hz，H-5'，9')，6.67 (2H，d，J=8.0 Hz，H-6'，8')，3.94 (1H，m，H-2')，3.89(1H，m，H-2)，2.61(2H，m，H-3a，3'a)，2.18 (2H，m，H-3b, 3'b)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:166.7(C-1)，166.5(C-1')，156.4(C-7')，136.5(C-4)，131.1(C-5'，9)，130.0(C-5，9)，128.2(C-6，8)，126.3(C-7，4')，115.1(C-6'，8')，55.9(C-2)，55.5(C-2')，39.4 (C-3')，38.7(C-3)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为环(苯丙氨酸-酪氨酸)二肽[3]。药理活性试验表明该化合物对心血管系统起作用，可降低心率、冠脉血流量、左心室收缩压和心脏传导速率[4]。

化合物2：白色粉末。ESI-MS m/z:211[M+H]+，233[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.34(1H，br s，NH)，4.13 (1H，t，J=8.0Hz，H-2)，4.02 (1H，d，J=8.0 Hz, H-2')，3.56(2H，m，H-5)，2.35(1H，m，H-3a)，2.13(1H，m，H-3b，)，2.07(1H，m，H-3'a)，2.04(1H，m，H-4a)，1.91(1H，m，H-4'b)，1.77(1H，m，H-4')，1.53(1H，m，H-3'b)，1.00(3H，d，J=6.5 Hz，H-6')，0.95 (3H，d，J=6.5 Hz，H-5')。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定该化合物为环（脯氨酸-亮氨酸）二肽[5]。研究表明该化合物对tsFT210 小鼠乳腺癌细胞有弱的活性[6]。

化合物3：白色粉末。ESI-MS m/z:245[M+H]+，267[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.36 (2H，d，J=7.0 Hz，H-6，8)，7.29 (1H，dd，J=7.0，6.5，Hz，H-7)，7.23(2H，d，J=7.5Hz，H-4，5)，5.70 (1H，br s，NH)，4.29(1H，dd，J=10.0，3.0 Hz，H-2')，4.08(1H，t，J=8.5 Hz，H-2)，3.54-3.67(3H，m，H-3'a，5'a，5'b)，2.78(1H，dd，J=14.0，10.5 Hz，H-3b)，2.38(1H，m，H-3a)，1.92-2.04(3H，m，H-3'b，4'a, 4'b)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为环（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽[7]。药理活性试验表明该化合物具有诱导生物发光的作用[8]。

化合物4：白色粉末。ESI-M m/z:261[M+H]+，283[M+Na]+。1H-NMR( MeOH-d4，500 MHz)δ:7.21-5.30(5H，m，H-5，6，7，8，9)，4.32(1H，t，J=4.5 Hz，H-2)，3.68(1H，dd，J=11.0，4.5 Hz，H-2')，3.30(1H, m，H -4')，2.95 (1H, dd，J =13.5，5.0 Hz，H -3a)，1.44(1H，m，H-3b)，0.88 (2H，m，H-3'a，3'b)，0.75 (3H，d，J=6.5 Hz，H-6')，0.70 (3H，d，J=6.5 Hz，H-5')。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为环（苯丙氨酸-亮氨酸）二肽[9]。该化合物可以被蚂蚁用作进攻或自卫的武器[10]。

化合物5：白色晶体。ESI-M m/z:197[M+H]+，219[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.84(1H，br s，NH)，4.09(1H，t，J=7.5 Hz，H-2')，3.95(1H，br s，H-2)，3.64 (1H，m，H-5'a)，3.56 (1H，m，H-5'b)，2.65(1H，m，H-3'a)，2.39 (1H，m，H-3'b)，2.06 (2H，m，H-4a，4'b)，1.92 (1H，m，H-3)，1.07 (3H，d，J=7.2Hz，H-4)，0.91(3H，d，J=6.8 Hz，H-5)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为环（脯氨酸-缬氨酸）二肽[11]。药理活性试验表明该化合物具有抗鳗弧菌活性，MIC 为0.26nmol/mL[12]。

化合物6：白色针状晶体。ESI-M m/z:139[M+H]+，161[M+Na]+。1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ:10.36(1H，br s，H-8)，7.90 (1H，dd，J=8.5，1.5 Hz，H-2)，7.54(1H，dd，J=7.5，1.5Hz，H-4)，7.01 (1H，dd，J=8.0，1.0 Hz，H-5)，6.96 (1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-3)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为邻羟基苯甲酸[13]。药理活性试验表明该化合物有较好的抗真菌活性[14]。

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