姜黄素对IL-1β损伤的大鼠海马神经元的功能性保护作用及机制

黄　涛陈　锟李小强谭龙益

（1.上海市第一人民医院宝山分院，上海　200940；2.上海市华山医院北院，上海　201900；3.复旦大学附属中山医院，上海　200032）

姜黄素对IL-1β损伤的大鼠海马神经元的功能性保护作用及机制

黄涛1陈锟2李小强3谭龙益1

（1.上海市第一人民医院宝山分院，上海200940；2.上海市华山医院北院，上海201900；3.复旦大学附属中山医院，上海200032）

目的：探讨姜黄素对IL-1β损伤的大鼠海马神经元的功能性保护作用及其机制。方法：应用离体脑片记录技术，记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位（EPSP），给予Schaffer侧支高频电刺激（HFS）诱发长时程增强（LTP），观察不同药物处理组EPSP起始斜率的变化情况。结果：与对照组相比，IL-1β和N-甲基D-天冬氨酸（NM-DA）对大鼠海马脑片的LTP产生明显的抑制作用（P＜0105）；而姜黄素可部分拮抗IL-1β和NMDA对海马脑片LTP的抑制作用，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-1β、姜黄素和NMDA对大鼠海马神经元的基础突触传递无影响。结论：姜黄素对海马神经元具有功能性保护作用，其机制可能是作用于神经元细胞膜上的NMDA受体，拮抗IL-1β引起神经元功能异常。

HIV-1相关痴呆（HAD）；姜黄素；白介素1β（IL-1β）；长时程增强（LTP）；N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）

HIV感染中枢神经系统后可导致严重的神经系统并发症，其中艾滋病病毒相关认知障碍（human immunodeficiencyvirus-associatedneurocognitive disorders，HAND）表现为认知、运动和行为障碍。是最为显著的并发症之一，而高效抗逆转录酶治疗（highly activeantiretroviral therapy，HAART）不能减轻HAD患者脑病变程度，也不能阻断疾病的进展，对临床症状的改善也无帮助［1］。HIV-1及病毒蛋白可以直接损伤神经元，但其激活的巨噬细胞和小胶质细胞分泌的炎症介质如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6等引起的免疫炎症反应在HAND发病过程中起着更为重要的作用。离体研究证实IL-1β不仅是星形胶质细胞的强效激活剂，而且可以诱导产生TNFα、IL-6和一氧化氮（NO）［2］。整体实验发现IL-1可以刺激胶质细胞活化、增殖、神经元芽生、瘫痕结构形成、新生血管产生、NGF合成等；［3］这一切都表明IL-1在神经元损伤后的愈合和修复中起重要作用。白细胞介素1β毒性和肿瘤坏死因子α毒性最大，通过激活星形胶质细胞和小胶质细胞，持续 释放谷氨酸浓度，神经细胞膜上的NAMD受体激活，从而造成神经元的中毒损伤。姜黄素为一种天然提取的酚类色素，可降低氧化应激、抑制细胞凋亡、抑制NMDA受体介导的Ca2+内流，进而减轻兴奋性中毒的损伤而起到细胞保护作用［4］。已有研究表明姜黄素可以可拮抗HIV包糖蛋白gp120引起的神经毒性以及学习记忆障碍［5］，并可通过提高NMDA2B受体的表达进而拮抗gp120所致的兴奋性中毒作用。因此，我们应用离体脑片记录技术，观察姜黄素对IL-1β引起的海马脑片长时程增强 （longterm potentiation，LTP）抑制的影响并探讨其机制。

1.材料

1.1动物健康成年SD大鼠45只，上海西普尔-摘要司提供，合格证编号：2008001647154。

1.2主要试剂姜黄素、TL-1β和 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA），购于 Sigma；NaCl、CaCl2、NaH2PO4、NaHCO3、KCl、MgCl2、葡萄糖和戊巴比妥钠购于上海化学试剂厂。

2.方法

2.1实验分组采用随机数字表发将50只 SD大鼠平均分为9组（每组5只）：1）对照组:脑片仅孵育于人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中；2）TL-1β基线组：脑片孵育于含1×10-7mol/ L的TL-1β的ACSF中，仅给予脑片基础刺激；3）NMDA基线组：脑片孵育于含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，仅给予脑片基础刺激，不给于HFS；4）NMDA组：脑片孵育于含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，孵育完成后给予HFS进行LTP记录；5）姜黄素基线组：脑片孵育于含1μmol/L姜黄素的ACSF中，孵育完成后仅给予脑片基础刺激；6）姜黄素组：脑片孵育于含浓度为1μmol/L姜黄素的ACSF中，孵育完成后进行LTP记录；7）IL-1β组：脑片孵育于含1×10-7mol/L的ACSF中，孵育完成后进行LTP记录；8）IL-1β失活组：先将从母液中取出的IL-1β放在恒温水浴箱中，70℃水浴30分钟，使IL-1β失活。再稀释于ACSF中使其终浓度为1×10-7mol/L，脑片孵育完成后进行LTP记录；9）姜黄素加IL-1β组：脑片孵育于含1μmol/L姜黄素和含1×10-7mol/ LIL-1β的ACSF中，孵育完成后进行LTP记录；10）姜黄素加NMDA组：脑片孵育于含1μmol/L姜黄素和含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，给予HFS。

2.2脑片的制备 SD大鼠用戊巴比妥钠麻醉后快速断头取脑，脑组织放入冰冻4℃通氧人工脑脊液环境中，分离海马并用组织切片机切成横面400μm厚的切片，在潮湿加氧的槽中室温保存1h后，根据各组要求在ACSF中加入相应的药物继续孵育30min。最后脑片转入记录槽。在记录槽中单个海马脑片完全浸入在以 2mL/min恒定流速，持续灌注的ACSF液中。ACSF（mmol/L）:NaCl 124.0，KCl 3.0，MgCl22.0，CaCl2，NaH2PO41.25，NaHCO326.0，glucose 10.0，ACSF用95%O2和CO2平衡。pH值调到7.3-7.4。

2.3电生理记录使用绝缘的双极钨电极作为刺激电极，每隔30秒给予恒定电流刺激（50-400μA）Schaffer侧支，刺激强度和持续时间以能产生 30%-40%最大反应为宜，此为基础刺激。记录电极是充以ACSF中的玻璃微电极，尖端直径 1-3μm，中的ACSF阻抗为2-5MΩ。将一记录电极插入CA1区锥体细胞树突层 100-200μm，记录的电活动是给予电刺激后 CA1区锥体细胞树突层的兴奋性突触后电位 （EPSP），经放大器放大后，通过数模转换器在2.5KHz频率下数字化电信号，并贮存在电脑上。

2.4LTP的诱发 30min基础刺激后，用高频电刺激（HFS）Schaffer侧支轴突，在海马CA1区记录，共进行30min细胞外记录。频率100Hz持续1s串间隔20s，共两串，在海马CA1区记录EPSP的变化，进行60min记录。其中第45minEPSP起始斜率的值代表LTP的诱发和变化情况。若EPSP起始斜率增幅在20%以上，并维持30min以上为LTP成功诱发。3个基线组海马脑片首先给予基础刺激30min然后用相应药物灌注60min，同时继续给予基础刺激，不给予这3组高频电刺激。

3.统计学处理

给于脑片HFS后测量第45min EPSP的起始斜率，基础水平的百分数形式表示LTP的幅度。实验数据以均数±标准误（x±sE）表示。用Original7.0和pClamp9.0软件分析EPSP，计量资料用单因素方差分析（ANOVA）和t检验。P＜0.05有统计学意义。

4.结果

1.对照组大鼠海马脑片CA1区LTP的诱发

对大鼠海马脑片进行基础刺激30分钟并记录EPSP形状和幅度。然后然后给与HFS，以刺激脑片EPSP起始斜率为 100%计算，刺激后EPSP平均增大幅度为（138.21±2.69），见图A。

2.IL-1β1、姜黄素和NMDA对海马脑片CA1区基础突触传递的影响

分别给予IL-1β基线组、姜黄素基线组和NMDA基线组海马脑片30min基础刺激，记录海马脑片CA1区的EPSP。30min后给与HFS，EPSP起始斜率无明显变化，EPSP呈一平直线（图B-D）。姜黄素基线组和NMDA基线组EPSP起始斜率无明显变化。结果显示，IL-1β、姜黄素和NMDA对大鼠海马神经元的基础突触传递无影响。

3.姜黄素对IL-1β引起的海马脑片CA1区LTP抑制作用的影响

将浓度为质量浓度为1×10-7mol/L IL-1β与海马脑片共同孵育后，记录海马CA1区的LTP。IL-1β组海马脑片给予HFS后EPSP起始斜率增大至（134.08±3.04）%，与对照组相比有统计学差异 （P＜0.05，图E）。失活的IL-1β与海马脑片共同孵育后，LTP平均斜率为（139.37±2.69）%，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05，图F）。用姜黄素和IL-1β共同孵育海马脑片后，海马脑片的LTP部分恢复，EPSP的起始斜率为（140.17±2.87）%，与IL-1β组相比有统计学差异（P＜0.05，图H）。结果提示，姜黄素可部分拮抗IL-1β造成的大鼠海马LTP抑制，保护海马神经元的正常功能。

各组大鼠海马脑片CA1区LTP记录

4.姜黄素对NMDA引起的海马脑片CA1区LTP抑制作用的影响

将浓度为0.5mmol/L的NMDA与海马脑片共同孵育后，记录海马CA1区的LTP。给予脑片HFS后，LTP平均斜率为（109.01±2.18）%，与对照组相比有显著性差异（（P＜0.05，图I）。用浓度为1μmol/L姜黄素与0.5mmol/L NMDA共同孵育海马脑片后，LTP出现了部分恢复，EPSP的起始斜率恢复到（135.08±3.33）%，与NMDA组相比有统计学差异（P＜0.05），提示姜黄素可部分拮抗NMDA引起的LTP抑制（图J）。

A：对照组大鼠EPSP起始斜率；B：IL-1β基线组大鼠EPSP起始斜率；C：NMDA基线组大鼠的EPSP起始斜率；D：姜黄素基线组大鼠EPSP起始斜率。E：IL-1β组大鼠EPSP起始斜率；F：IL-1β失活组大鼠EPSP起始斜率；G：姜黄素失活组大鼠EPSP起始斜率；H：IL-1β+姜黄素组大鼠EPSP起始斜率；I：NMDA组大鼠EPSP起始斜率；J：NMDA+姜黄素基线组大鼠EPSP起始斜率。图的基线斜率为100。

HIV感染或被gp120激活的小胶质细胞可释放炎症趋化因子。如TNF-α和IL-1β等。这些细胞因子可刺激单核吞噬细胞释放L-半胱氨酸，L-半胱氨酸可激活NMDAR并引起神经元凋亡。HAD患者脑内会有IL-1β及其受体表达的升高。目的在于研究HAD中的神经毒素类之间的相互作用的实验发现IL-1β可促进神经元凋亡并可被IL-1β阻滞剂阻滞。而对于神经系统的病变来说，IL-1β的升高也参与了CNS神经元的病理进程。研究表明神经系统病变中，IL-1β水平的升高主要是激活神经胶质细胞如神经胶质细胞和小胶质细胞的结果。因而参与了由急、慢性炎症反应参与的神经退行性疾病的发病过程。研究发现脑内多个部位都有IL-1β及其受体的表达：海马，纹状体，下丘脑，大脑皮质以及脑干，且它们的表达因发育状况而有所变化。目前的表明研究：神经胶质细胞激活所分泌的细胞因子可诱导合成一定量的急性期蛋白，如淀粉蛋白A。这些蛋白可进一步影响神经元的代谢活性，导致神经元损伤和凋亡；此外合成的急性期蛋白本身又可促进IL-1，TNF和在神经胶质细胞和小胶质细胞中的表达。有研究表明IL-1，TNF的神经毒性主要通过过度刺激NMDA受体，使得Ca2+通道开放，过多Ca2+流入细胞内造成神经元损伤。临床研究表明Alzheimer痴呆和血管性痴呆患者的外周血IL-1β的水平表达增加。［6-7］

现代医学研究表明，姜黄素在神经退性性疾病的治疗当中，可发挥重要的作用。姜黄素可抑制HIV慢性感染的HIV-1 LTP（long terminal repeat，LTR）活性和病毒复制，提示姜黄素对处于前病毒状态的病毒有作用，姜黄素可能直接或间接地作用于影响HIV-1 LTR活性调节因子。另外姜黄素可能通过抑制转录因子NF-的活化在其抗HIV复制的过程中具有重要意义。推测姜黄素用于感染患者的治疗，可增加机体的体液免疫功能，防止继发性感染。近来的研究表明姜黄素还可以抑制HIV-1复制所需的蛋白酶和整合酶进而抑制病毒的复制。［8］

长时程增强是突触部位传递效能增强的一种现象，是突触可塑性的表现型式，也是学习和记忆的细胞电生理指标［9］。本研究中大鼠海马脑片孵育IL-1β后，脑片的LTP发生了明显抑制，说明IL-1β对海马神经元功能是产生了抑制作用。而用姜黄素和IL-1β共同孵育海马脑片后，海马脑片的LTP部分恢复，因此可知，姜黄素可以部分拮抗IL-1β造成的大鼠海马LTP抑制，保护海马的正常功能。本研究把海马脑片孵育于浓度0.5mmol/L的NMDA后，脑片的LTP发生了明显抑制，而当姜黄素和NMDA共同孵育海马脑片后，海马脑片的LTP也出现了部分恢复。说明毒性剂量的NMDA引起NMDA受体的过度激活，造成海马神经元功能障碍，出现LTP抑制，姜黄素可部分拮抗NMDA受体激活引起的LTP抑制。［8］［10］因此姜黄素对海马神经元具有功能性保护作用，其机制可能是作用于神经元细胞膜上的NMDA受体，拮抗IL-1β引起的神经元功能异常。

［1］ELLIS R，LANGFOR D D，MASLIAH E.HIV and antiretroviral therapyin the brain:neuronal injury and repair［J］. NatRevNeurosc，i 2007，8（1）:33-44.

［2］LeeSC，eksonD，LiuW，etal.Induetion of nitriC oxide synthase ACtivity in human astroeytes by IL-1β and IFN-［J］.J Neuroimmunol，1993，46:19-24.

［3］Rothwell NJ，Relton JK.Involvement of Cytokines in a Cute neurodegeneration in the CNS［J］.Neurosei Biobehavior Rev，1993，17:217-227.

［4］AHUJA K D K，KUNDE D A，BALLM J，eta.l Effects of capsaicin，dihydrocapsaicin，and curcumin on copperinduced oxidation of human serum lipids［J］.J Agric Foos Chem，2006，54（17）:6436-6439.

［5］黄涛，董军，陆大祥，等.CREB在姜黄素改善gp120所致大鼠学习记忆障碍中的作用［J］.暨南大学学报（医学版），2008，29（4）:362-36.

［6］Kindt S，Vanden Berghe P，etal.Prolonged IL-1beta exposure altersneurotransmitter andelectricallyinducedCa2+ responses in the myenteric plexus［J］.Neurogastroenterol Motil 2010，（22）:321-e85.

［7］GougeonPY，LourenssenS，eta.ThePro-Inflammatory Cytokines IL-1β and TNFα Are Neurotrophic for Enteric Neurons［J］.J Neurosci.2013，33（8）:3339-51.

［8］Guo L，Xing Y，Pan R，eta.Curcumin protects microglia and primary rat cortical neurons against HIV-1 gp120-mediated inflammation and apoptosis［J］.J Nat Prod.2013，76（6）: 1105-12.

［9］梅镇彤.学习记忆的神经的神经机制［J］.生理科学进展，1996，27（3）：183-188.

［10］QIU Z，SWEENEY D D，NETZEBAND J G，ETAL.Chronic interleukin-6α lters NMDA recepter-mediatedmem brane responses and enhances neurotoxicity indevel-oping CNS neurons［J］.J Neurosci，1998，18（24）:10445-10456.

（责任编辑：夏万夫）

黄涛（1974-），男，安徽铜陵人，上海市第一人民医院宝山分院主任助理，主管检验师，硕士，研究方向：临床检验。

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A

1671-752X（2015）01-0031-04

2014-12-11