鹿结核病诊断技术研究新进展

郝景锋，张秀峰，刘立明，张宇航，崔永镇，李心慰，刘国文

（1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林132101 ；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨150030；3.吉林大学动物医学学院，吉林 长春130062）

鹿结核病（Deer tuberculosis）是一种慢性、消耗性人兽共患传染病，对养鹿业危害巨大，梅花鹿等多个鹿种均可感染本病，严重制约着养鹿业的健康发展。现有研究表明，牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）是鹿结核病的主要病原体，随着养鹿业的快速发展，作为对鹿养殖业危害巨大的鹿结核病越来越受到社会的重视和关注。但鹿结核病的诊断一直没有规定性标准，鹿结核病诊断方法主要参照牛结核病的诊断，现将各种诊断方法汇报如下。

1 临床诊断

鹿结核病是一种慢性、消耗性疾病，临床主要表现为渐进性消瘦，食欲下降，精神沉郁，被毛杂乱失去光泽，皮肤弹性下降，结核菌主要侵害呼吸系统，主要表现为呼吸困难，张口呼吸，气喘，先干咳后湿咳，胸部听诊时出现干性、湿性啰音或胸膜摩擦音，母鹿可出现空怀或产弱胎，公鹿生茸量降低，甚至不产茸。本病病程通常较长，可长达数月甚至数年，死于衰竭。临床症状诊断虽然快捷，但不是很精确，只能作为诊断参考。

2 病理解剖学诊断

在经过流行病学调查以及必要的临床诊断基础上，病理解剖是诊断鹿结核病一种常用并且较为可靠的方法，鹿结核病主要病变在于肺部以及淋巴结，在肺纵隔、肠系膜、乳房等部位出现粟粒至豌豆大小不等的结核结节，甚至互相融合，变成大的干酪样坏死，初期较为坚硬，后期柔软，触之如生面团样感，切开肿大的淋巴结，流出大量黄白色且无异味的脓汁，浆膜结核由于大小相似，呈透明或者半透明状，形如珍珠，俗称“珍珠肿”。

3 病原学诊断

对于鹿结核病的病原学诊断包括染色镜检和病原培养后分离鉴定。

根据鹿发生结核的不同部位采集病料，主要采集脑脊液、痰液、脓汁、胸水、腹水、粪便以及尿液等病料，直接或经过集菌后涂片检查，集菌的方法有离心沉淀或稀释飘浮法等，经抗酸染色后在显微镜下观察，菌体细长略弯曲，球杆状，呈红色，直径0.4 μm，长1～4 μm，无鞭毛，不形成芽孢，传统认为无荚膜，最新研究证实结核分枝杆菌的细胞壁外有一层荚膜。由于在制片过程中受到破坏，故观察不到。若先用明胶处理样本，可防止荚膜由于脱水而收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，具有一定的保护作用。

4 结核菌素试验诊断

结核菌素试验是鹿结核病诊断的一种非常重要方法，也是世界卫生组织（WHO）推荐、在世界各地普遍使用的结核病常规诊断方法，它是基于Ⅳ型变态反应原理的一种皮肤试验。结核菌素试验可为接种卡介苗及测定免疫效果提供依据。

5 血清学诊断

鹿结核病血清学诊断被公认为一种比较确实的诊断技术，目前应用较多的血清学诊断包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、干扰素诊断法、斑点免疫金渗滤法以及免疫印迹法。

5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） Engvall 和Perlman 1971 年首次报道建立酶联免疫吸附试验，由于ELISA 具有快速、简洁、敏感、易于标准化等优点，迅速得到发展并广泛应用。1976 年ELISA 诊断正式应用于结核病患者抗体检测[1]，一直作为结核菌素试验诊断的必要补充，ELISA 方法众多，诊断技术不断完善，间接ELISA 法目前在结核病诊断中应用广泛，王启军等对鹿结核病间接ELISA 诊断试剂盒开展了广泛的实验研究，成功制备了兔抗鹿酶标抗体[2]。对结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）、KNO3以及KCl 等浸出抗原进行了系统的筛选，从而为成功研制出鹿结核病间接ELISA 诊断试剂盒奠定了基础。

5.2 r 干扰素诊断法 γ干扰素释放试验分析技术IGRA（interferon-γ release assay ，IGRA）是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的新方法。

PPD 与非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）和卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）有成分交叉[3]，易导致“假阳性”，因此，在普遍接种卡介苗地区（如我国），对结核菌素皮肤试验（TST）阳性结果的判定需谨慎。近年来，一种诊断结核病的免疫学新方法-γ 干扰素释放分析（IGRA）逐渐被推广并应用于临床。IGRA 利用结核分枝杆菌而非牛分枝杆菌BCG 株系表达的抗原刺激外周血单核产生IFN-γ。检测血样于12～18 h 后判定试验结果，在2011 年以前，全球只有英国和澳大利亚两种γ干扰素释放试验（IGRA）试剂盒被批准使用[4]，2011 年7 月，我国研发生产的IGRA 试剂盒(A.TB)正式获国家食品药品监督管理局批准。因为具有高敏感性和高特异性，并且不受卡介苗和大多数非致病分枝杆菌的影响，IGRA 在结核诊断中对实验设备、操作人员以及实验条件要求较高，因此在广大基层无法大范围推广使用。

5.3 斑点金免疫渗滤测定法 1971 年Faulk 和Taytor 将胶体金引入免疫化学，此后斑点金免疫渗滤测定法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。斑点免疫金渗滤测定法作为免疫胶体金技术中重要组成部分在结核病诊断中发挥着重大的作用。吴波等研究表明，用DIGFA 检测结核分枝杆菌抗体对肺结核的诊断，具有敏感性高、特异性强等特点，操作简便、快捷，与涂片法、培养法和PCR 相比，对肺结核诊断有明显的优势，具有较高的应用价值[5]。但DIGFA 在实际研究及应用过程中仍存在一些不足之处：首先，在检测过程中常出现假阴性和假阳性问题。其次，检测的重复性及灵敏程度仍然有待于提高，检测的范围需要进一步拓展。

5.4 免疫印迹法 免疫印迹法（Western blotting）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有特异性强、敏感性高等特点，广泛应用于新抗原的鉴定以及抗体的联合检测，该法目前技术比较规范，分辨率高、特异性强、可适合大样本检测，具有较强的应用前景。

6 结核病感染鹿的实验模型

建立感染实验模型的方法可解决自然感染结核病传播以及流行速度慢、养殖试验动物花费巨大甚至可能造成人畜共患发生等一系列研究自然发病规律的不便，现实意义重大，建立感染实验模型对于结核病病原学、发病机制、深入诊断研究是十分必要的，此项技术在国外已有应用，但在国内目前此项技术没有报道，McNair J 于2001 年将102-104CFU 菌株通过鹿扁桃体感染，研究表明其病理变化与自然感染病例十分相似[6]，Griffin 于1995-1999 年通过鹿扁桃体攻毒试验，研究表明，10-1CFU 剂量牛型结核菌通过扁桃体感染，52%以上鹿症状明显，102CFU 剂量牛型结核菌对100 多只鹿进行多次感染，研究发现90%以上实验动物出现症状，由于该法对鹿损伤过大，产生的经济损失太大，因此目前应用较多的是小组实验法（N=10-15）[7]，有报道显示，目前美国学者通过建立感染实验模型的方法研究白尾鹿结核病。

7 分子生物学诊断

应用分子生物学技术检测结核分枝杆菌，克服了传统检测方法的诸多不足，能够对难以培养、生长缓慢的结核分枝杆菌进行更加快速、特异、敏感、准确的鉴定与分析，对于结核病的防控起到了其他方法无法替代的作用。结核病常规的分子生物学诊断技术有聚合酶链式反应（PCR）、DNA 指纹技术、生物芯片技术以及核酸探针技术等。

7.1 PCR 检测法 在应用分子生物技术检测鹿结核病中目前最常见和适合使用的方法就是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），1985 年美国Muliis 等发明PCR，Young 等建立了结核杆菌基因文库，成功地分离、鉴定结核杆菌抗原蛋白编码基因。1989 年PCR 技术首次应用于结核病诊断，该项技术灵敏度高、特异性强，很快得到极大的肯定和广泛应用，Ritelli 等将从巨噬细胞系中分离培养的分枝杆菌进行收集培养后，采用半巢氏PCR 检测牛结核分枝杆菌中的特异性插入片段IS6110，判定是否含有牛型结核分枝杆菌[8]。Aderem A 等1999年利用2个长度为20个碱基的寡核苷酸引物PCR扩增编码牛结核分枝杆菌分泌蛋白MPB70 的目标基因，扩增产物为372 bp 长度DNA 片段，此产物可通过琼脂糖凝胶电泳检测到，且特异性强[9]。刘桂香等用结核分枝杆菌引物对12 份鹿的组织样本进行PCR检测，结果11份出现阳性反应，阳性率为91.6%，细菌培养物1 份为阳性[10]。刘思国等根据已发表的牛型结核分枝杆菌的pncA 基因序列，设计特异性引物并扩增出了大小为294 bp 的目的片段，成功地构建了牛结核分枝杆菌特异性检测的PCR 方法[11]，取得了令人满意的效果。

7.2 DNA 指纹技术 DNA 指纹是指完全具有个体特异的DNA 多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，可用来进行个人识别及亲权鉴定，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹是独一无二的，故称为“DNA 指纹”。此技术通常用于菌种鉴定，从而可以调查结核病的暴发流行，检测结核病病原菌来自体内还是体外再感染、病原菌敏感性检查等流行病学方面的研究，当前主要应用的有DRE-PCR、Spoligotyping、IS6110-PCR 以及PCR-RELP 等[12]。

7.3 生物芯片技术 生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对基因、细胞、蛋白质及其他生物组分的快速、准确、大信息量的检测，是目前分子生物学最前沿的技术[13]，按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。

7.4 核酸探针法 核酸探针（Nuclear Acid Probe）是指用放射性或非放射性物质标记已知的DNA或RNA 片段。核酸探针技术最大优势是特异性强，已在不同种群结核杆菌鉴定和结核病诊断上的许多方面显示出重要的应用价值和应用前景。在结核病诊断中应用的核酸探针技术主要有寡核苷酸探针、全染色体DNA 探针、RNA 或cDNA 探针及PCR 扩增片段探针[14]。

综上所述，本文从病理学、细菌学、免疫学以及分子生物等方面系统地论述了鹿结核病诊断技术的最新研究进展，不同时期不同的诊断技术都发挥了至关重要的作用，对于不同的诊断技术应该根据实验条件、诊断目的和具体情况综合考虑并全面分析，随着分子生物的不断进步，相信不久的将来鹿结核病的诊断技术会越来越规范统一，为鹿养殖业的健康发展发挥重要作用。

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