淡水生物污损群落中细菌的分离鉴定及观察

刘念等

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生长是生物污损层形成的初级阶段。从长江水体分离得到3株淡水黏附菌，并对其形态特征、生长黏附特性、16S rDNA基因序列和量子点标记进行了初步研究。结果显示，3个菌株在玻片上迅速黏附，实验室培养生长旺盛。菌落和菌细胞均具有相似的形态特征，菌落球形突起，厚实，圆润光滑，边缘清晰，颜色有差异，且随培养基成分而有所改变。胞体呈短杆状，天然水体培养基上生长较缓慢，菌落形态有所不同，但仍能很好生长。天然流动水体完全可提供这些菌株生长所需养分，在固形物表面迅速黏附生长。

关键词：淡水黏附菌；形态特征；细菌生长；量子点标记

中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2882-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.018

Separation and Observation of Bacteria in Biofouling Biocoenosis

LIU Nian，XIONG Yan-fei， PENG Jun-jiang，XU Han-zhi，LIAO Li-jing，CAI Xiao-yu， XU Yun

（Institute of Biological Sciences and Technology，Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， China）

Abstract：It is the first stage of bio-fouling layer formation when microorganisms stick to the solid surface underwater. We separated three bacterias from the Yangtze River， and first studied their morphological character， character of growth and adhesion， 16S rDNA gene-base phylogenetic， and quantum dot labeling. Results show that three strains can stick to glass quickly， and grow fast under lab culture condition. Bacteria colony and cell all have similar morphological character； a colony is globular， thick， smooth and has clear edge. But the colors of three strains are different， changing with culture medium. Single bacterium is short rod shaped；poor growth rate in natural water medium is observed； the colony morphology looks different， but still can grow well. Natural river condition can provide enough nutrients to perfectly ensure the fast growth and adhesion on the solid surface.

Key words： freshwater adhesion of bacteria； morphological character； growth of bacteria； quantum dot labeling

在海洋环境中，海洋生物依附于船舶表面和海洋水下设施生长，造成海洋生物污损[1]。研究表明，海洋生物污损过程可分为4部分，分别是基膜的形成、微生物膜的形成、海藻孢子和原生动物的附着、大型污损生物的附着。形成基膜的有机分子或无机颗粒最开始是简单的物理吸附过程，随着环境的变化吸附与脱附持续进行[2]。最先附着的微生物的生长会增加表面的粗糙度和疏水性[3]，细菌通过产生多糖、蛋白质、核酸和脂类，形成的胞外基质将自己包裹而得到保护[4]，生物膜形成后很难清除。防垢层表面的有机物又能作为微生物再生长的碳源[5]，进一步引导海绵、水螅、海藻、石灰虫以及藤壶、贝类等次级生物附着。生物污损是不可逆的，给航运、海防及水产养殖等行业带来巨大经济损失和安全隐患。

量子点是一种具有纳米尺寸的半导体晶体。与传统的荧光染料相比，量子点拥有许多独特的光学特性，如宽的吸收谱、窄而对称的发射谱、耐漂白、亮度高和荧光寿命长等。由于其出色的光物理特性和相对较小的尺寸，量子点可作为生物学研究的荧光探针[6]。本研究对长江水体黏附细菌的分离、鉴定以及不同条件下的生长及细菌量子点标记等进行论述，研究了分离的淡水黏附菌的基本特性，摸索了水溶性ZnO量子点对实验菌的标记方法，为后期进一步研究生物污损群落中细菌的附着生长及抑制附着的因素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

对照菌：大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）由武汉大学微生物保藏中心提供。

实验菌：取自长江水域。

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基，3种以江水及其内容物为营养源的培养基（培养基Ⅰ为同水域江水经8层纱布与3层脱脂棉组合过滤后加琼脂灭菌，培养基Ⅱ为同水域江水静置后虹吸上清液加琼脂灭菌，培养基Ⅲ为同水域江水与少量水下生物污损层固形物混匀后加琼脂灭菌）。

量子点：ZnO量子点水溶液由武汉理工大学材料学院王艺峰老师提供。

主要试剂：十二烷基硫酸钠（SDS）溶液购买于上海碧云天生物技术有限公司，其他常用试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验菌的分离培养与纯化 在长江武汉段黄鹤楼轮渡引桥水线下约20 cm处悬挂灭菌载玻片，分别于0.5、1、2、6、24 h取出实验菌，采用影印法，将载玻片上菌体印迹至牛肉膏蛋白胨固体平板上，37 ℃恒温培养24 h，观察比较挂片不同时长后玻片黏附菌的数量及种类。选取优先黏附、数量较多的3种菌落，平板划线法进行多次分离纯化，获得3个主要菌株，根据菌落颜色分别命名为AB-w（Adhesion bacteria—white）、AB-y（Adhesion bacteria—yellow）、AB-ly（Adhesion bacteria—light yellow），作为实验菌株。

1.2.2 实验菌的生长及菌落观察 3种实验菌分别在培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ上，于实验室条件下，37 ℃培养，作菌落形态观察，与富营养培养基上生长菌落比较。

1.2.3 实验菌生长曲线测定 挑取经37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨琼脂斜面保种的实验菌两环，接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃恒温空气摇床100 r/min培养20 h，作为实验用菌液。上述菌液以1%接种量接种于costar 3599型无菌带盖96孔酶标板中，每孔100 μL，设置8个平行，37 ℃恒温空气摇床100 r/min，酶标仪测定630 nm处的吸光值（OD），绘制生长曲线。

1.2.4 菌体形态观察 对实验菌进行革兰氏染色，观察菌体形态。以金黄色葡萄球菌或大肠杆菌混合涂片染色作进一步对照。

1.2.5 菌株AB-w的DNA提取、序列扩增测定及比对 挑取菌体于50 μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物裂解缓冲液（Code No.9164）中，80 ℃、15 min变性后离心取上清作为模板。使用TaKaRa 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒（Code No.RR176），进行PCR扩增目的片段。反应条件为94 ℃ 5 min，一个循环；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30个循环；72 ℃ 5 min，一个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒（Code No.9762）切胶回收目的片段进行DNA测序，由大连宝生物工程有限公司完成。获得序列进行Blast搜索。

1.2.6 系统发育树的构建 系统发育分析来源有约翰不动杆菌（A.johnsonii，Z93440）、溶血不动杆菌（A.haemolyticus，Z93437）、沃氏不动杆菌（A.lwoffii，U10875）、鲍曼不动杆菌（A.baumannii，HE978267，HE651907）、琼氏不动杆菌（A.junii，ABl01444）以及醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus，AFl59045）。外群为莫拉氏菌（Moraxella lacunata，AF005165）[7]。应用软件MEGA6邻接法构建系统发育树。

1.2.7 SDS对实验菌生长及黏附的影响 实验操作参照前述1.2.3进行，添加SDS至浓度分别为0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，设置4个平行。培养至46 h后去培养液，加入100 μL结晶紫染色液染色1 min，去染色液，无菌去离子水洗去残留染液，加入200 μL无水乙醇，37 ℃恒温空气摇床100 r/min抽提10 min，酶标仪测定490 nm处的吸光值。

1.2.8 ZnO量子点水溶液标记实验菌及黏附情况观察 挑取经37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨琼脂斜面保种的实验菌两环，接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃恒温空气摇床100 r/min培养3 h，离心去上清液，菌体以少量新鲜液体培养基充分悬浮。分别取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

无菌EP管中依次加入菌悬液500 μL，ZnO量子点水溶液200 μL，PBS（pH 7.4）200 μL，EDC（0.1 mol/L）100 μL[8]，混匀后37 ℃恒温空气摇床100 r/min培养30 min，对实验菌进行标记。结束后取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

另取无菌玻璃培养皿（90 mm），将无菌玻璃片以无菌琼脂紧贴于侧壁，加入15 mL新鲜液体培养基，分别加入200 μL经ZnO量子点标记的3种实验菌中的2种，另一种实验菌未标记，37 ℃恒温空气摇床100 r/min培养30 min，去培养液，无菌去离子水15 mL分3次洗涤培养皿，镊子取出玻璃片，擦镜纸擦去底面残余琼脂，1 mL灭菌去离子水清洗玻璃片，火焰固定，充分水洗。OLYMPUS IX71型倒置荧光显微镜紫外激发下观察荧光。

2 结果及分析

2.1 实验菌的分离培养

从长江武汉段江水中悬挂盖玻片上影印培养得到大量菌落，如图1所示。

悬挂0.5 h的玻片上即有大量菌体附着，可见不同颜色菌落，以白色居多，大小不一。随着时间延长附着菌体迅速增加，24 h即可覆满整个玻片表面，菌落细小，密集、整体呈黄色，难以区分不同菌落。0.5 h悬片印迹生长的菌落，菌落均突起，不透明，圆形，表面光滑、湿润，从大小及颜色上至少可区分有3个主要菌落，经进一步分离纯化，得3种菌株，分别记为AB-w、AB-y、AB-ly。

自然环境条件下，养分供应相对缺乏，温度较低，细菌生长会缓慢一些。挂片取样时，前6 h主要为菌体的附着过程，在玻片表面，菌体附着迅速，见图1。0.5 h即开始有菌体黏附，至6 h时几乎覆盖了整个玻片表面，但菌体的黏附似乎并不是完全随机的，从图1的a至d，菌体并非均匀分布于玻片表面，而是较倾向于聚集成片，即已黏附菌体对后续菌体的黏附有一定的引导作用，对此，将进一步观察研究。

2.2 实验菌的生长及菌落观察

AB-w、AB-y、AB-ly在牛肉膏蛋白胨培养基上生长迅速，24 h即可形成饱满圆润直径约2 mm的菌落，60 h后菌落直径约3～4 mm，菌落颜色明显（图2）。AB-w菌落白色，圆润，呈球形突起，表面光滑；AB-y菌落黄色，形态与AB-w相似；AB-ly菌落浅土黄色，形态与AB-w相似。划线边缘处菌落均明显较密集区菌落大，说明营养充足时均能很好地生长。

在以江水及其内容物作为营养源的培养基上，3个菌株生长明显要缓慢。培养24 h后，在培养基Ⅰ上可见AB-w形成微小菌落，AB-y和AB-ly未见明显生长。培养至60 h，3个菌落均肉眼可见，但菌落大小、颜色和形态均有着明显的变形（图3）。AB-w菌落直径约0.2～0.3 mm，略透明，边缘较整齐光滑，颜色不明显；AB-y菌落直径约0.1～0.2 mm，圆形或近圆形，中部凸起，边缘较不整齐，略透明；AB-ly菌落直径约0.5～1.0 mm，边缘不规则，圆形或近椭圆形，铺展，透明。相较于培养基Ⅰ上，3个菌株在培养基Ⅱ上形成的菌落均较厚实，略大，质地较不均匀，中部略凹陷，应为营养相对缺乏的原因。在培养基Ⅲ上，3个菌株生长水平又稍有提高，菌落明显变大，形态更加接近球状，颜色特征依然不明显。可见，在营养相对缺乏的天然水体环境中，3个菌株仍可较好地生长，其中，以AB-w生长最为迅速，菌落较大，数量最多，为水体中的优势菌种。天然流动水体中的营养物质完全可满足这些菌株迅速生长，为次级附生生物提供养分。

2.3 实验菌的生长曲线测定

图4为实验菌在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长曲线。由图4可见，由于接种采用的是液体培养物，前后培养环境差异不大，实验条件下，细菌分裂迅速，对数期可持续5～16 h。在前5 h，AB-w生长迅速，之后相当长的一段时间内处于稳定期，至46 h依然无明显下降趋势；AB-y与AB-ly曲线类似，前16 h生长较好，稳定期较短约为8 h，之后明显下降。

2.4 菌体形态及革兰氏染色鉴定

菌株AB-w、AB-y、AB-ly与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌混合革兰氏染色结果见图5。AB-w革兰氏阴性，杆状，长2～3 μm，宽1～3 μm，长宽比接近1.4∶1（图5a）；AB-y革兰氏阳性，杆状，菌体长3～5 μm，宽2 μm左右，长宽比接近2.1∶1（图5b）；AB-ly革兰氏阴性，杆状，菌体长3～4 μm，宽2 μm左右，长宽比接近1.5∶1（图5c）。3种菌体形态上具有明显的共同特征，胞体短杆状，较大肠杆菌大。

2.5 16S rDNA 基因序列分析

将扩增得到的16S rDNA基因电泳检测，测得其序列长度为1 451 bp。经Blast序列分析，结果表明细菌AB-w与不动杆菌同源性最高。从GenBank中调取与细菌AB-w同源性较高的菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育树（图6），结果显示，AB-w与鲍曼不动杆菌（A.baumannii）在同一分支中，一致性达到了100%。根据菌株的形态学特征和16S rRNA基因序列分析，鉴定细菌AB-w为鲍曼不动杆菌（A.baumannii）。

2.6 SDS对实验菌抑制生长及促进黏附作用

不同浓度的SDS对3种实验菌都有明显的抑制生长的效果，SDS能在短时间内控制实验菌的生长（图7）。结晶紫染色后可明显观察到与未添加SDS组相比，添加SDS不能明显减少实验菌的黏附，此现象在前期采用玻璃片作为实验菌黏附对象，采用印迹计数菌落时也出现过。

2.7 量子点对实验菌的标记效果及标记实验菌黏附分析

经处理的ZnO量子点能一定程度上标记实验菌，单独处理一种实验菌，计数不同显微视野下的标记率可以达到51%～99%，波动较大；同时标记2种实验菌，另一种未标记，将3种菌混合培养，对荧光及明场下玻璃表面的黏附菌体数量进行比较，同样存在标记率波动较大的现象。AB-w未标记组，标记率在27.4%～79.0%；AB-y未标记组，标记率在38.2%～88.3%；AB-ly未标记组，标记率在38.0%～78.3%。相比而言革兰氏阴性菌似乎更易被标记。单一实验菌标记如图8所示。

3 小结与讨论

从长江水体分离得到3株淡水黏附菌，在玻片上粘附迅速，实验室培养生长旺盛。菌落和菌细胞均具有相似的形态特征，菌落球形突起，厚实，圆润光滑，边缘清晰，颜色有差异，且随培养基成分而有所改变。胞体呈短杆状，AB-w与AB-ly革兰氏染色阴性，AB-y革兰氏染色阳性。天然水体培养基上生长较缓慢，菌落形态有所不同，主要表现为营养缺乏时，菌落沿培养基铺展生长。天然流动水体中完全可提供这些菌株生长所需养分，特别是在春夏季，这些菌株可在水中固形物表面迅速黏附生长，促进次级附生生物的附着生长，形成生物污损层，造成生物腐蚀。

对AB-w进行了16S rDNA基因序列分析，其测试结果显示为鲍曼不动杆菌，与该菌的革兰氏染色结果与强黏附性相一致。学者针对鲍曼不动杆菌的研究主要针对其耐药性[9，10]，未有系统研究其强黏附作用与生物污损的关系。

低浓度的SDS溶液即可快速而显著地控制实验菌的生长，由于SDS溶液易起泡，加样时难免产生少许气泡，气泡虽然可以在4 h内全部消除，但仍然会对前期测量产生一定的影响。细菌生长受到抑制的情况下，其黏附结果受影响不大，甚至黏附量增多，其原因还待进一步研究。

实验条件下，水溶性ZnO量子点标记实验菌的效果一般，其中AB-w与AB-ly两种革兰氏阴性菌标记效果相对较好，革兰氏阳性菌AB-y效果较差。采用金黄色葡萄球菌与大肠杆菌作为被标记物时，结果同样如此。更适合的标记条件与标记质量的影响因素待进一步研究。

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