HTLV—1蛋白酶与印地那韦识别的分子动力学模拟

常珊等

摘要：对HTLV-1蛋白酶和抑制剂印地那韦的复合物进行了11 ns的分子动力学模拟，从分子整体、氢键、结合自由能及运动性等方面进行了分析。结果表明，动力学模拟使得体系更为松弛，但大部分氢键仍得到保持；疏水相互作用有利于HTLV-1蛋白酶和印地那韦的结合，关键残基主要分布在R10、L30～V39、V56～F67和W98～I1004个区域；结合自由能预测值与试验数据吻合较好。印地那韦结合仅能部分抑制HTLV-1蛋白酶的Flap、top-site以及两个exo-site位点柔性，解释了印地那韦的HIV-1 PR抑制活性为何略大于HTLV-1 PR。该研究为基于受体结构的抗HTLV-1药物研发打下了一定的结构和理论基础。

关键词：HTLV-1蛋白酶；印地那韦；分子动力学模拟；分子识别；结合自由能

中图分类号：O641.3；R969.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-3034-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.062

Molecular Dynamics Simulation of the Recognition between HTLV-1

Protease and Indinavir

CHANG Shan1，LIANG Li2，LIU Wei2，HU Jian-ping2，3，GOU Xiao-jun2

（1. Institute of Bioinformatics and Medical Engineering， Jiangsu University of Technology， Changzhou 213001， Jiangsu China；

2. Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development， Chengdu University， Chengdu 610106， China；

3. College of Chemistry， Leshan Normal University， Leshan 614004， Sichuan China）

Abstract： One 11 ns molecular dynamics simulation （MD） for the compocind system of Human T-cell leukemia virus type 1（HTLV-1） protease （PR） and its inhibitor indinavir was performed. The mutual recognition of the two molecules was analyzed from exploring the whole molecule，hydrogen bond，binding free energy and mobility，etc.After dynamics simulation，the system keeps more relaxed compared with the crystal structure， and most of the hydrogen bonds were still maintained. Both energy decomposition and free energy calculation showed that，hydrophobic interaction facilitates the association of HTLV-1 PR and indinavir，and key residues were mainly distributed in the four regions including R10，L30～V39，V56～F67 and W98～I100.Additionally，binding free energy prediction was in good agreement with the experimental data. Indinavir can only partially attenuate the flexibility of the flap，top-site and two exo-site in the PR system，which investigated why indinavir possess more HIV-1 PR inhibition ability than that of HTLV-1 PR. The study will provide some structural and theoretical basis for anti-HTLV-1 drug research based on the receptor structure.

Key words： HTLV-1 protease； Indinavir； molecular dynamics simulation； molecular recognition； binding free energy

I型人类T细胞白血病病毒（Human T-cell leukemia virus type 1，HTLV-1）参与了众多种类癌症，如成人T细胞白血病、热带痉挛性脊髓病以及HTLV-1相关的皮炎等[1，2]。目前，世界上约2 000万人感染了该病毒，临床治疗策略主要是采用细胞毒性化疗及干扰素、齐多呋定用药，开展抗HTLV-1的新型药物研发比较迫切[3]。

HTLV-1蛋白酶（Protease，PR）是同源蛋白二聚体，每个链由125个氨基酸残基，属于天冬氨酸蛋白酶家族[4，5]。HIV-1蛋白酶被认定为抗AIDS药物研发的一线靶点已有30年历史，目前FDA已经批准10多种HIV-1蛋白酶抑制剂药物上市[6]。而HTLV-1 PR和HIV-1 PR的序列同源性为28%，其中抑制剂结合区同源性更高，达到了45%。两类PR尽管具有相似的整体折叠，但是有不同的抑制剂结合特异性[7]。大部分HIV-1 PR抑制剂没有体现出抑制HTLV-1 PR的潜力，目前仅有HIV-1蛋白酶抑制剂印地那韦能够在较低的微摩尔级层次上抑制HTLV-1 PR活性，抑制常数为3.5 μm[8]。

图1给出了印地那韦的分子结构，分子式为C36H47N5O4，由主链（C10-C11-C12-C13-C21-N4）和侧链部分（比如吡啶基、哌嗪基、叔丁基，苯基，茚基）组成。综合考虑HTLV-1 PR和HIV-1 PR的结构类似性和印地那韦的双重抑制活性，本研究利用分子动力模拟方法研究了印地那韦和HTLV-1 PR的相互作用，将有助于后续的印地那韦类抗HTLV-1 PR抑制剂的设计。

1 模拟方法

1.1 分子动力学模拟

基于HTLV-1蛋白酶结合抑制剂印地那韦的复合物晶体[9]结构，仅保留A链和B链接的氨基酸部分以及底物印地那韦，以此作为分子动力学（Molecular dynamics，MD）模拟的初始构象。MD模拟应用AMBER程序[10]，采用的力场是AMBER力场，蛋白质的力场参数均基于试验值拟合[11]，模拟温度为300 K，溶剂采用TIP3P水模型[12]。在溶质印地那韦外围加上1.0 nm的去头八面体水盒子，总共加入9 913个水分子，含水后体系的总原子数为33 453。在MD模拟之前，对体系进行两次能量优化：①约束溶质[约束力常数为2.09×103 kJ/（mol·nm2）]，用最陡下降法优化5 000步，再用共轭梯度法优化5 000步；②去约束后，再进行5 000 步最陡下降法优化和5 000步共轭梯度法优化，收敛条件为能量梯度小于4.18×10-4 kJ/（mol·nm）。

MD 模拟分为两步：首先进行1 ns约束溶质的MD 模拟[（约束力常数为41.8 kJ/（mol·nm2）]，温度从0 K逐步升高到300 K；再进行10 ns的无约束恒温MD模拟，用VMD 图像显示软件实时跟踪体系的构象。采用SHAKE 算法[13]约束键长，MD模拟的积分步长设为2 fs，非键相互作用截断半径设为1.2 nm，每隔1 ps采集1次构象，共采集11 000个构象。

1.2 MM-PBSA自由能计算

用MM-PBSA（Molecular mechanics/Poisson-Boltzmann surface area）方法[14，15]计算了HTLV-1 PR和底物印地那韦的绝对结合自由能，该方法通过从复合物的MD模拟轨迹中每隔一定的时间间隔提取出体系结构，计算出平均结合自由能，计算公式为：

ΔGbind=ΔH-TΔS≈ΔEMM+ΔGsol-TΔS

式中，ΔGbind是结合自由能，ΔH是焓变，TΔS是绝对温度和熵变的乘积；ΔEMM是真空下分子内能差，包括分子非极性能差（VDWIN）和分子静电能（ELEIN）差；ΔGsol是溶剂化自由能，ΔEMM可通过分子力学方法计算得到，ΔGsol由极性溶剂化自由能差（ELEPB）和非极性溶剂化自由能（VDWPB）差组成，极性部分通过求解有限差分Poisson-Blotzmann（PB）方程求得[16-18]，非极性部分通过估算溶剂可接近表面积（Surface area，SA）[19]拟合得到。TΔS的计算采用了正则模方法[20]。

1.3 能量分解

能量分解采用MM/GBSA（Molecular mechanics/generalized Born surface area）方法[14，15]，将每个残基的能量贡献近似分为用分子力学（MM）方法计算的真空分子内能、用广义波恩（GB）模型[21，22]计算的极性溶剂化能，以及用LCPO模型[23，24]计算的非极性溶剂化能，并且把能量分解到残基的主链原子和侧链原子上。其中，真空分子内能是由极性部分（静电相互作用）和非极性部分（范德华相互作用）组成的。LCPO模型的核心是非极性溶剂化能与分子溶剂可接近表面积正相关，通过MM/GBSA能量分解，可以考察蛋白质中的主要残基对于结合底物分子所做的贡献。本研究基于HTLV-1蛋白酶与抑制剂印地那韦的复合物体系，MD 模拟平衡后6.5～11.0 ns 内的轨迹（共4.5 ns），每隔100 ps采样一次，共取45个构象，通过计算获得所有构象的平均能量分解结果。

1.4 构象成簇

对体系MD 模拟所获得的11 000 个分子构象进行了成簇分析，分析采用MMTSB工具[25]，计算过程依据Daura等[26]报道的策略。逐个计算各个构象间的RMSD值，随后建立RMSD矩阵（N×N，N为构象数）。设定一个RMSD域值，如体系两个构象之间的RMSD小于该域值，则将它们归为一簇，最后将每簇中能量最低构象作为该簇的代表性结构。本研究的成簇分析则是建立HTLV-1 PR-印地那韦复合物体系整体RMSD矩阵，即计算各个体系间的整体RMSD值，以分析基于整体构象的成簇分布，进而依据构象所占概率获得分子整体所体现出的优势构象。

2 结果与分析

2.1 体系的整体动力学

2.1.1 势能及回转半径 图2给出了HTLV-1蛋白酶与印地那韦复合物体系的势能和回转半径（Radius of gyration）随时间的变化。从图2A可以看出，在约束溶质的MD模拟初级阶段（即0～1 ns之间），势能平均值和标准偏差分别是-405 811×105 kJ/mol和6 477×105 kJ/mol，偏差率为1.6%。在去约束的MD模拟阶段（即1～11 ns之间），势能维持在-（414 201±681）×105 kJ/mol，偏差率为0.2%。在长时间全含水MD模拟中，体系势能维持稳定，模拟过程及轨迹可靠。从图2B可以看出，HTLV-1蛋白酶结构最初保持约束状态（0～1 ns之间），回转半径数值稳定，均值为1.895 nm；在去约束后的1.0～5.5 ns之间，回转半径涨落幅度变大，均值为1.899 nm；经过5.5～6.5.0ns的回转半径（均值1.913 nm）快速增加阶段，蛋白质已经去掉了晶体中固有的大部分约束和碰撞，结构更松弛。在6.5～11 ns之间，回转半径维持在1.930 nm附近涨落。

2.1.2 RMSD分析 图3给出了复合物RMSD随时间的变化。从图3可以看出，HTLV-1 PR在0～1 ns的约束MD模拟过程中，RMSD非常稳定，均值维持在0.01 nm；在1.0～5.5 ns区间对应的数值为（0.13±0.01） nm，5.5～6.5 ns为RMSD快速增加区间，在6.5～11.0 ns区间，对应的数值为（0.19±0.01） nm。A链和B链的RMSD走势稍有差别，A链在1.0～5.5 ns区间的RMSD要低于B链，5.5 ns之后，二者走势趋同。就印地那韦而言，从模拟开始到3.0 ns之间，RMSD迅速提高到0.3 nm，随后逐渐保持平稳，数值为（0.22±0.02） nm，略大于蛋白质部分，可见小分子有较高的运动性。与图2B所示的回转半径结果相比，蛋白质部分RMSD和回转半径数值快速增加的时间节点相同，均为5.5～6.5 ns之间，蛋白质RMSD走势与回转半径有较强相关性。另外，蛋白质A链与B链的运动性略有不同，相对而言A链略高于B链。

2.1.3 RMSF分析 方均根涨落（Root mean square deviation，RMSF）是体系原子相对于平均构型的方均根涨落，反映了体系在整个模拟中原子的平均变化情况。RMSF数值大说明对应位置的柔性大，反之相反。图4给出了HTLV-1蛋白酶二聚体的A链和B链的Cα原子的RMSF及柔性分布。从图4A可以看出，HTLV-1蛋白酶的两条链RMSF分布类似，这里将RMSF值大于0.4 nm和小于0.2 nm的区域分别定义为柔性区和刚性区。可见，柔性区有S46～N53，G60～F67和F80～T83；刚性区有A29～V39，A99～A105。图4B直观给出了体系柔性的区域分布，柔性大的区域都是远离结合部位的无规卷曲或β片；刚性区则是直接参与识别抑制剂IND，也包括附近刚性较大的α螺旋区。另外，A链的柔性略高于B链。

在X-ray试验中，蛋白质的B因子（B-factor）体现了晶体中原子电子密度的模糊度（Diffusion），模糊度实际反映了蛋白质分子在晶体中的构象状态。B因子越高，模糊度越大，相应部位的构象柔性越大。将基于X-ray试验获得的B因子和MD模拟获得的RMSF进行了相关性分析。HTLV-1蛋白酶A链和B链的Cα原子B因子及RMSF数据的相关性，相关性值分别为0.66和0.91（图5A、图5B）。在116个样本数前提下，相关性非常高，可见蛋白质A链和B链的柔性分布类似，也表明用X-ray和MD方法来表述蛋白质柔性分布的有效性。蛋白质A链及B链的B因子和RMSF数值的相关性，相关系数分别为0.56和0.71（图5C、图5D）。综上，基于RMSF分析得到的蛋白质柔性分布结果可信，模拟所得轨迹可以用于后续分子间识别的探讨。

2.2 分子识别

2.2.1 氢键分析 根据图3的RMSD分布，分析了7.0～9.0 ns之间的氢键分布。氢键采用几何判据[27]，供体和受体之间距离小于0.35 nm，供体-氢-受体的夹角大于135°，氢键占有率表示在整个模拟过程中氢键构象出现的几率。从表1可以看出，参与抑制剂印地那韦和蛋白酶识别的有6个氢键，氢键给体涉及到抑制剂的O2、O4、N1和N4原子，贯穿小分子的大部分结构。氢键是促进印地那韦与HTLV-1蛋白酶特异性识别的重要作用力。X-ray试验结果[28]表明，R10、D32、G34、D36、A59、W98能与印地那韦形成氢键，在全含水MD优化后，大部分氢键得到了保持。

图6给出了HTLV-1蛋白酶B链D32-OD2与印地那韦-O2-H18间最稳定氢键的距离及角度随时间的变化。在7～9 ns间，受体-供体距离和受体-氢-供体角度维持稳定，涨落幅度较小，在2 000个构象中，共有1 889个构象均保持有印地那韦-O2-H18-D32-OD2氢键（占有率为94.45%）。

2.2.2 结合自由能计算 基于HTLV-1蛋白酶-印地那韦复合物7～9 ns的MD模拟轨迹，删除水分子和4个平衡氯离子，然后从该轨迹中每隔200 ps取一次构象，共11个构象用于自由能计算，最终结果通过取平均得到。表2列出了各能量项对结合自由能的贡献，用MM-PBSA方法计算得到的结合自由能模拟值-32.87 kJ/mol。印地那韦抑制HTLV-1蛋白酶的抑制常数Ki为3.5 μmol/L，相应的ΔGbind试验值为-31.33 kJ/mol，自由能计算值和试验值非常吻合。

在形成蛋白酶-印地那韦复合物时，体系的范德华相互作用（VDWIN）和非极性溶剂化能（VDWPB）都有利于底物的结合；体系的静电相互作用则是不利于底物的结合，主要表现在尽管真空条件下分子静电能（ELEIN）有利于底物的结合，但是极性溶剂化能（ELEPB）极其不利于二者识别，并直接反转了ELEIN有利于结合的趋势。体系熵效应（TS）是不利于底物结合的，这与分子间识别基本都是熵减效应一致。

2.2.3 能量分解及结合模式 为了研究HTLV-1蛋白酶与抑制剂印地那韦的相互作用，同时考虑到用GB模型计算静电省时间的因素，用GBSA方法计算了蛋白酶结合印地那韦所涉及到的重要残基能量贡献。

表3给出了HTLV-1蛋白酶中与抑制剂印地那韦识别密切相关残基的能量分解结果（能量小于-0.5 kJ/mol），表中的右上角撇号表示B链。从表3可以看出，利于HTLV-1蛋白酶与印地那韦结合的关键残基主要分布在4个区域：R10、L30～V39、 V56～F67、W98～I100。其中A链和B链有利于结合印地那韦的关键残基分别是10和11个。其中在A链和B链都出现的关键残基有7个，具体为R10、G34、A35、V56、G58、W98和I100。尽管蛋白质A链和B链空间上中心对称，小分子也结合在正中间，但是由于小分子结构并不对称，具有一定的空间异构性，A链及B链对于结合印地那韦的贡献类似，但不尽相同，该结果与之前RMSD（图3）及RMSF（图4）分析结果一致。B链的F67也是促进蛋白质与小分子识别的关键残基，这个残基在晶体结构[28]中并没有被提到。

基于上面的能量分解结果，图7给出了HTLV-1蛋白酶与印地那韦的识别模式。图中蓝色和绿色stick模型分别表示关键残基，蛋白质整体用flat-ribbon模型表示。

2.3 分子的运动性

用MMTSB软件包[25]对MD模拟轨迹11 000个构象进行了成簇分析。图8给出了基于相互RMSD对比的复合物体系整体构象成簇分析结果，其中RMSD阈值设为0.13 nm。MD模拟构象共分为5簇，2.5 ns之前基本为第1簇，共2 460个构象，所占概率为22.36%；2.5～6.3 ns之间为第2簇，共3 484个构象，占比31.67%；第3簇则主要是出现在9.0 ns后，构象数和占比分别为1 447和13.15%；第4簇和第5簇的时间区间基本为6.0～9.0 ns之间。值得一提的是，第3簇、第4簇和第5簇构象有较为明显的交叉跃迁现象，尤其第4簇和第5簇之间。

图9给出了HITLV-1蛋白酶与抑制剂印地那韦复合物体系的每簇代表性构象的叠落结果。代表性结构指的是每个体系各簇中能量最低构象，即第1～5簇代表性构象代码分别为1 754、4 220、10 998、8 410和7 745。图9A给出了基于蛋白质主链Cα原子重叠的5个代表性构象叠落结果。蛋白质A，B链部分的Flap、top-site以及两个exo-site位点叠落较差，相应区域的柔性非常大。药物筛选研究试验[29]表明，flap、top-site、exo-site等长loop区较高的柔性是抑制剂与蛋白酶结构不够稳定的结果。印地那韦抑制剂与HTLV-1蛋白酶抑制剂的结合力要弱于与HIV-1蛋白酶的识别，这能够部分解释loop区柔性为何较高。

另外，在代表性构象中首先保证小分子哌嗪环（N1-C1-C2-N3-C8-C9）重叠，然后进行叠落操作，结果如图9B所示。蛋白质相应区域都是中心对称，由于印地那韦的不对称导致其与蛋白酶结合和运动具有一定的复杂度。印地那韦的吡啶、哌嗪环和叔丁基主要与B链结合，运动幅度较小，这与之前的RMSD和RMSF分析一致；印环基则主要靠近A链，叠落效果最差，运动幅度也最高；而苯环基主要靠近B链的R10残基，柔性居中。

3 结论

基于HTLV-1蛋白酶和抑制剂印地那韦的复合物长时间显含水的分子动力学模拟，分析了二者的相互作用机制。体系的回转半径和方均根偏差分析表明，与晶体结构相比，HTLV-1蛋白酶-印地那韦复合物构象在水溶液中逐渐松弛，且A链柔性略高于B链。蛋白质A链及B链的B因子和RMSF数值有很高的相关性，相关系数分别达到0.56和0.71，表明柔性分析合理。柔性大的区域都是远离结合部位的无规卷曲或β片；刚性区则是直接参与识别抑制剂印地那韦，也包括附近刚性较大的α螺旋区。能量分解表明，HTLV-1蛋白酶与印地那韦结合的关键残基主要分布在R10、L30～V39、V56～F67和W98～I100等4个区域。用MM-PBSA方法获得HTLV-1蛋白酶和抑制剂印地那韦的结合自由能计算值（-32.87 kJ/mol）与试验值（-31.33 kJ/mol）吻合较好，其中，体系的范德华相互作用和非极性溶剂化能都有利于二者结合运动性分析表明，蛋白质A，B链部分的Flap、top-site以及两个exo-site位点叠落较差，相应区域的柔性非常大；而印地那韦抑制剂的印环基则主要靠近柔性较大的A链，叠落效果最差，运动幅度也最高。模拟结果为基于HTLV-1蛋白酶受体结构的印地那韦类抑制剂设计有一定的指导意义。

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