菜豆植物凝集素活性的测定方法研究

李佳楠等

摘要：探索分光光度法测定菜豆（Phaseolus vulgaris）植物凝集素活性的最佳测定条件，分析了56个菜豆品种的植物凝集素活性。结果表明，红细胞悬液浓度2×108个/mL，凝血10 min后测定OD416 nm，为菜豆植物凝集素的最佳测定条件。在该条件下，分析了56个菜豆品种中的植物凝集素活性浓度，旨在为分析菜豆植物凝集素的毒效提供参考。

关键词：菜豆（Phaseolus vulgaris）；植物凝集素；分光光度法；活性

中图分类号：S532 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-3005-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.053

Determination of the Activity of Lectin in Kidney Bean

LI Jia-nan，YANG Wei，YUAN Sha，CHEN Chan-you

（Department of Biotechnology， Life Science College， Jianghan University， Wuhan 430056， China）

Abstract： The optimal detecting lectin activity in Phaseolus vulgaris by spectrophotometry and 56 varieties were analyzed in this paper. The results showed that the suitable concentration of red blood cell was 2×108 cell/mL， and the best coagulation time was 10 min and detected at 416 nm. The lectin activity concentration of 56 varieties were determined under to the established conditions to provide a reference for the toxic effects analysis of lectin in Phaseolus vulgaris.

Key words： Phaseolus vulgaris； lectin； spectrophotometry； activity

菜豆（Phaseolus vulgaris）为豆科一年生草本植物，别名四季豆、芸豆、豆角，是常见食用蔬菜[1]，但其中的植物凝集素（PHA），胰蛋白酶抑制剂，皂甙和植酸等对人体均有一定的毒性作用，常常导致菜豆中毒事件[2-5]。植物凝集素是植物界中广泛存在的一类能够可逆结合到特异单糖或多糖上的蛋白质，其相对分子量为126～136 kDa，含有4个亚基，每个亚基都有1个与糖结合位点，能使红细胞产生凝集现象[6，7]。迄今为止，在已发现的1 000多种菜豆植物凝集素中，豆科植物凝集素有600多种[8]。

红细胞凝集法是目前应用最为广泛的植物凝集素检测方法[9]。该方法利用兔、羊、人等动物红细胞，配制成一定浓度的红细胞悬液，将凝集素溶液经过倍比稀释后加入等体积红细胞悬液，静置一段时间后，通过肉眼观察或比色测定活性[10-12]。但目前已报道的凝集素测定方法多为定性或半定量方法，难以定量分析凝集素浓度与血细胞凝集效应之间的关系。本试验采用分光光度法优化了菜豆植物凝集素标准品的活性测定条件，并测定了56个菜豆品种的植物凝集素活性浓度，为验证菜豆植物凝集素的毒效关系提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菜豆鲜荚由江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心试验基地提供。供试样品均为2012～2013年春季栽植，选取菜豆开花后15 d成熟荚作为研究对象，共计56个品种；菜豆植物凝集素标准品（纯度98%，Sigma）；Alsevers（Biosera）；兔红细胞悬液自制；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菜豆豆荚浸提液的制备 将新鲜菜豆豆荚打碎成浆后，称取10 g，加入PBS溶液定容至10 mL，4 ℃摇床振荡浸提24 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液作为待测样液，每样分别提取3次。

1.2.2 兔红细胞最大吸收波长测定 取兔静脉血，配制成2×108个/mL的红细胞悬液，取100 μL加入酶标板，全波长酶标仪（200～1 000 nm）测定血细胞的吸光值。

1.2.3 不同红细胞浓度下的凝血反应 在酶标板中每孔加入100 μL的1 mg/mL菜豆植物凝集素标准品，以二倍稀释法设置7个浓度梯度，浓度在1～0.015 625 mg/mL之间，每个浓度设置3个平行。将兔红细胞配制成浓度为2×108、1×108、5×107个/mL的红细胞悬液，每孔加入20 μL红细胞悬液，且每个红细胞浓度设置3个平行。混合均匀，静置10 min，测定OD416 nm，绘制菜豆植物凝集素凝血活性浓度曲线。

1.2.4 不同凝集时间下的凝血反应 将兔红细胞配制成2×108个/mL的红细胞悬液，于酶标板中每孔加入100 μL的上述梯度浓度的菜豆植物凝集素标准溶液，每浓度设置3个平行。每孔加入20 μL的2×108个/mL红细胞悬液。混合均匀，静置观察，分别于5、10、20 min测定OD416 nm，绘制菜豆植物凝集素凝血活性浓度准曲线。

1.2.5 菜豆植物凝集素活性浓度测定 酶标板每孔加入100 μL菜豆豆荚浸提液和100 μL PBS缓冲液，充分混匀，每个样品设3个复孔。每孔加入20 μL的2×108个/mL红细胞悬液，室温静置10 min，测定OD416 nm，通过上述曲线方程计算菜豆植物凝集素浓度。

2 结果与分析

2.1 菜豆凝集素测定的最佳条件

兔红细胞的光谱图见图1。由图1可知，当吸收波长为416 nm时，浓度为2×108个/mL的兔红细胞悬液具有较大吸光值，因此选择416 nm作为测定波长。

将浓度分别为2×108、1×108、5×107个/mL的红细胞悬液滴加到7个浓度梯度的菜豆植物凝集素标准品溶液中，凝集时间10 min，测定OD416 nm，绘制标准曲线，结果显示3个浓度的红细胞均有明显凝血效应，其中浓度为2×108个/mL红细胞的凝血反应标准曲线线性较好（图2），故选择2×108个/mL作为红细胞的工作浓度。

在红细胞浓度为2×108个/mL时，分别测定放置5、10、20 min时，7个菜豆植物凝集素标准品的凝血效应。以OD416 nm做标准曲线，结果显示凝血时间为10 min时，标准曲线线性最好（图3），故选择10 min作为反应时间。

2.2 菜豆品种植物凝集素凝集活性浓度

根据菜豆植物凝集素测定的最佳条件和标准曲线方程y=-0.658 0x+1.442 7，测定56个菜豆品种豆荚中的植物凝集素凝集活性，结果见图4。

由图4可知，菜豆凝集素总体活性浓度水平差异较大。活性浓度最高是40号（10.85 mg/g），最低是45号（0.025 mg/g），56个菜豆品种可以分为2个品种群：①高活性浓度品种群（4.36～10.85 mg/g），共5个品种，即40号、38号、33号、44号和6号；②低活性浓度品种群（0～2 mg/g），其余51个品种。而在2～4.36 mg/g之间没有品种分布。

3 讨论

目前凝集素活性的测定方法主要分为两大类：一类以观察血细胞凝集效果的定性分析，如V形酶标板法、平板法、试管法等[10-12]；另一类是以分光光度计及酶标仪测定的特定波长吸光度的半定量分析方法[13]。这些方法通常存在以下不足：①只能定性或半定量测定；②配制标准红细胞悬液多用体积百分数来表示，不能定量分析结果，且批次间结果差异大；③确定读取终点时间的随意性较大，肉眼观察结果的主观性大，精确度低；④测定方法多种多样，测得的结果千差万别，难以重复。

本试验优化了分光光度法测定菜豆植物凝集素的条件，测定了不同菜豆的植物凝集素活性。在植物凝集素测定中，通过制备已知数量的红细胞悬液，降低各批次间测定的不确定性，同时通过标准曲线将样品菜豆的凝集素活性换算为浓度，实现菜豆中植物凝集素活性浓度的定量分析。该方法较传统测定方法更客观，适用于大量样本同时快速检测，试验结果为分析不同来源及品种菜豆植物凝集素的毒效关系提供了参考。

参考文献：

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