白藜芦醇通过Sirtuins 1通路促进自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤

石 瑶，郭 倩，周也涵，万 丹，叶秀峰

(重庆医科大学 基础医学院 病理学教研室 神经科学研究中心， 重庆 400016)



研究论文

白藜芦醇通过Sirtuins 1通路促进自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤

石 瑶，郭 倩，周也涵，万 丹，叶秀峰*

(重庆医科大学 基础医学院 病理学教研室 神经科学研究中心， 重庆 400016)

目的观察白藜芦醇(Res)在大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)损伤中脑保护作用与自噬的关系。方法随机将大鼠分成假手术组(S组)、脑缺血/再灌注模型组(I/R组)、低和高剂量(15和40 mg/kg)Res处理组(R1和R2组)，其中将R2组另设2个亚组：R2+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和R2+Sirt1抑制剂Sirtinol 组。线栓法构建大鼠I/R模型。缺血2 h,再灌注24 h后，用尼氏染色观察皮质区的组织学形态；用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑组织的梗死体积；用real-time QPCR和Western blot检测脑组织中Sirt1和LC3的mRNA和蛋白表达。结果与S组相比，I/R组大鼠可见明显的脑梗死灶，显微镜下见病理损伤改变，自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Sirt1表达均有上升。Res预处理后，能明显减轻I/R大鼠皮质区的病理损伤，减少脑梗死体积(P<0.01)，显著增加I/R大鼠脑组织中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Sirt1的表达(P<0.01)；而Sirt1抑制剂及3-MA能削弱Res的作用。结论Res减轻大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的脑保护作用可能与Res通过提高Sirt1的表达进而促进自噬来完成的。

脑缺血/再灌注损伤；白藜芦醇；自噬；沉默信息调控因子1

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种广泛存在于虎杖、葡萄和花生等植物性食物或药物中的非黄酮类多酚小分子物质，具有抗感染、抗氧化、神经保护和抗肿瘤等多种生物学活性[1]。本实验的前期研究结果表明[2]，Res预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤有神经保护作用，与文献[3]报道相符，且进一步研究发现保护机制可能与其诱导自噬的发生有关。然而，Res是在脑缺血/再灌注损伤中如何诱导激活自噬机制尚待阐明。

沉默信息调控因子1(sirtuins 1,Sirt1)是广泛存在于哺乳动物中NAD+依赖的去乙酰化酶，有研究发现Sirt1的表达及活性上调能够诱导自噬的激活[4]，且被认为Res是目前为止发现最强的Sirt1激动剂[5]，在神经变性疾病中，Res能通过上调Sirt1进而诱导自噬发生起到神经保护作用，对延缓神经变性疾病进展有重要意义[6]。

本实验旨在探讨Res对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤中脑保护作用与自噬的关系，并进一步探讨其可能机制，找寻药物作用的靶点，以期为缺血性脑血管疾病的预防及临床治疗提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

SPF级SD大鼠(雄性)72只，体质量250～300 g[重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(渝)2007-0001]。将大鼠随机分成4个组：假手术组(S组，n=16)、脑缺血/再灌注模型组(I/R组，n=16)、低和高剂量(15和40 mg/kg)Res处理组(R1组，n=16和R2组，n=24)，其中将R2组另设两个亚组：R2+3-MA组和R2+Sirtinol组。

1.2 药品与试剂

白藜芦醇(纯度99%，Genview公司)；3-MA、Sirtinol、DMSO和TTC(Sigma公司)；RNAiso Plus、PrimeSriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒和SYBR® Premix Ex Taq®试剂盒(TaKaRa公司)；鼠抗-Sirt1单克隆抗体和兔抗-LC3多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗-β-actin多克隆抗体(北京四正柏公司)；HRP标记山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京百泰克公司)。蛋白裂解液和凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.3 大鼠脑缺血/再灌注损伤模型制备及给药

采用改良的Longa等[7]大脑中动脉内线栓阻断法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立局灶性脑缺血再灌注(I/R)模型，缺血2 h,再灌注24 h。S组：手术过程同I/R组，但线栓插入深度10 mm即可。R1组和R2组大鼠在用药前称重，分别给予Res低和高剂量(15和40 mg/kg)腹腔注射，每天1次，第7天于术前30 min给药。S组和I/R组大鼠予以DMSO和0.9%氯化钠注射液处理，给药方式及剂量同Res处理组。R2+3-MA组和R2+Sirtinol组大鼠于术前30 min用微量注射器向右侧脑室(前囟点旁开1.6 mm，向后0.9 mm，腔深3.8 mm)分别给药3-MA 5 μL(50 μg)、Sirtinol 5 μL(3.94 μg)。在模型制备过程中均用白炽灯加热，维持肛温37 ℃左右。术后大鼠麻醉苏醒后，参照Longa的评分标准[7]，模型入选标准为1～3分，实验组随机补全，保证各组动物的数量不变。

1.4 尼氏染色法观察尼氏体表达

大鼠缺血2 h,再灌注24 h后麻醉、心脏灌洗，冰上断头取脑、4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。切片行常规尼氏染色后用中性树胶封片。在显微镜下观察脑组织切片的染色情况，可见尼氏体存在于胞浆中呈深蓝色颗粒。

1.5 Real-time QPCR检测Sirt1和LC3 mRNA的表达

1.5.1 引物设计及合成：用Primer 5.0 软件设计大鼠目的基因LC3、Sirt1和β-actin的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 大鼠目的基因LC3、Sirt1和β-actin的引物序列Table 1 Primer sequence of the rat LC3, Sirt1 and β-actin target gene

1.5.2 脑组织总RNA的提取：将各组大鼠于术后24 h断头处死，快速取出右侧大脑组织的额顶叶皮质，按RNAiso Plus提取试剂盒说明书提取组织的总RNA，检测总RNA的浓度和纯度，对A260/A280比值为1.8～2.2的样品进行下一步实验。

1.5.3 Real time QPCR反应：按反转录试剂盒说明书合成cDNA作为模板，进行real time QPCR反应。引物序列：见表1。25 μL反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 15 s，39个循环。以2-△△Ct(Ct代表循环阈值)表示基因的表达量△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.6 Western blot检测Sirt1和LC3的蛋白表达

术后24 h，提取各组脑组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，上样电泳，蛋白经湿转法转至PVDF膜上，TBS漂洗膜3次， 封闭液(质量分数为5%脱脂奶粉溶于1×TBST缓冲液)室温封闭1 h，将膜置于溶有一抗Sirt1或LC3或β-actin的封闭液中，室温0.5 h，4 ℃过夜。次日用TBST漂洗膜3次，将膜放入已用封闭液稀释的二抗中，室温1h，TBST漂洗膜3次。ECL显影，调节BIO-RAD凝胶成像仪的参数进行曝光采图，Quantity one软件分析，测定并计算出LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ、Sirt1与β-actin条带吸光度值比值，进行统计学分析。

1.7 TTC染色测定脑梗死的体积

用TTC染色法测定大鼠脑梗死体积。术后24 h，深度麻醉大鼠，立即断头取出除嗅球、小脑和低位脑干后的剩余脑组织，放于脑冠状切片槽中，均匀切成厚度为2 mm薄片，迅速放入质量分数为2%的TTC染液中，避光，37 ℃染色20 min后观察脑片颜色，红色为正常组织，苍白色为梗死灶，用体积分数为4%的多聚甲醛避光固定6 h，拍照，应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测量并计算出脑梗死的体积。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 尼氏染色对大鼠皮质区的形态学观察

S组大鼠皮质区的神经细胞形态结构正常，胞质内可见丰富的深蓝色颗粒，即尼氏小体；I/R组神经细胞的结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少且淡染；经不同浓度Res预处理后，R1和R2组减轻了大鼠皮质区异常形态学改变，增加了尼氏小体的数量；而R2+3-MA组和R2+Sirtinol组大鼠皮质区的病理改变加重，但比I/R组仍有改善(图1)。

2.2 Real time QPCR检测Res对Sirt1和LC3 mRNA表达水平的影响

与S组相比，I/R组脑组织Sirt1和LC3 的mRNA表达增加(P<0.01)，经不同浓度Res预处理后，Sirt1和LC3 的mRNA表达进一步上调，其中R2组差异更明显(P<0.01)(图2A)；Sirtinol处理组mRNA表达降低，3-MA处理组LC3 mRNA表达被抑制，但仍高于I/R组(P<0.01)(图2B)。

2.3 Western blot检测Res对Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达水平的影响

与S组相比，I/R组脑组织Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达增加(P<0.01)，经不同浓度Res预处理后，Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达进一步增加，其中R2组差异更明显(P<0.01)(图3A)；Sirtinol处理组二者蛋白表达下降，3-MA处理组LC3 蛋白表达被抑制，但仍高于I/R组(P<0.01)(图3B)

A.S group; B.I/R group; C.R1 group; D.R2 group; E.R2+3-MA; F.R2+Sirtinol

A.expression of Sirt1 and LC3 detected by real time QPCR；B.Sirtinol and 3-MA changed the expression of Sirt1 and LC3 detected by real time QPCR；*P<0.01 compared with S group;**P<0.01 compared with R2 group;#P<0.01 compared with I/R group;ΔP<0.01 compared with R1 group

图2 Real time-QPCR分析中各组Sirt1和LC3 mRNA的转录水平

2.4 脑梗死体积检测

I/R组出现明显的脑梗死灶，经Res预处理后，R1和R2组梗死体积减小，R2组差异更明显(P<0.01)；Sirtinol处理组和3-MA处理组脑梗死体积有所增大，但仍小于I/R组(P<0.01)(图4)

3 讨论

缺血性脑血管疾病是临床上常见病和多发病，具有高致残率、高囜死率等特点，严重威胁公众健康。自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统[8]，LC3是自噬标记性蛋白，具有LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ两种形式，LC3 Ⅱ含量或LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值增高可反映自噬活性的增强[9]。研究表明[10- 11]，自噬在局灶性脑缺血/再灌注损伤中可被诱导激活且起保护作用。Res属于非黄酮类多酚化合物，结构简单，具有抗感染、抗氧化、神经保护和抗肿瘤等强大的生物学作用[1]。本研究发现，与S组相比，I/R组大鼠出现明显的脑梗死灶和病理学改变，以及LC3的表达增加，经Res预处理后R1和R2组脑缺血/再灌注损伤引发的病理改变减轻，脑梗死体积减少及LC3的表达进一步增加，这与本实验前期研究结果一致[2]。且本实验进一步研究表明，与R2组相比，给予自噬抑制剂3-MA共处理3-MA+R2组，脑组织LC3表达降低，病理改变加重且脑梗死体积增加。证实Res可诱导脑I/R自噬激活发挥脑保护作用。

A.expression of Sirt1 and LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ detected by Western blot；B.Sirtinol and 3-MA changed the expression of Sirt1 and LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ detected by Western blot;*P<0.01 compared with S group;**P<0.01 compared with R2 group;#P<0.01 compared with I/R group;ΔP<0.01 compared with R1 group

图3 各组神经元中Sirt1和LC3蛋白的表达

red.normal brain tissue; white.infarction tissue;*P<0.01 compared with I/R group; #P<0.01 compared with R1 group；ΔP<0.01 compared with R2 group图4 脑冠状切片TTC染色

Sirt1作为一种NAD+依赖的去乙酰化酶，在哺乳动物脑神经元中高表达，调节神经的损伤修复及神经保护[12]。众所周知，Res被认为是目前为止发现的最强Sirt1激动剂[5]。研究表明，在神经变性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病)中，Res能通过上调Sirt1进而诱导自噬发生起到神经保护作用，对延缓神经变性疾病进展有重要意义[6]。

为了研究Res诱导激活脑I/R自噬的机制，进一步检测了Sirt1的表达。实验结果显示脑I/R模型中Sirt1 mRNA和蛋白表达上调，Res预处理R1和R2组可促进Sirt1表达进一步增加，Sirt 1抑制剂Sirtinol处理后，Res介导的Sirt1和LC3表达上调被抑制，且脑梗死体积增加，认为Sirt1确实参与了Res诱导的自噬调控。

综上所述，本实验结果表明Res在脑缺血/再灌注损伤中诱导自噬的发生起脑保护作用，Res诱导激活自噬对脑缺血/再灌注起保护作用的机制可能与上调Sirt1的表达及活性有关,为缺血性脑血管疾病的预防及临床治疗提供新的研究依据。

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SHI Yao, GUO Qian, ZHOU Ye-han, WAN Dan, YE Xiu-feng*

(Dept. of Pathology, Institute of Neurosciences,Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

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cerebral ischemia/reperfusion injury; resveratrol; autophagy; sirtuins1

2014- 10- 13

2014- 12- 29

重庆市科技攻关计划项目(2008AB5118)

1001-6325(2015)04-0496-06

R741；R285.5；R-332

A

*通信作者(corresponding author)：yxf1960@126.com