GP78基因多态性与冠心病相关

查额尔敦巴特，付真彦，董春岚，王 蓓，黄 定

(新疆医科大学 第一附属医院 心脏中心 冠心病科, 新疆 乌鲁木齐 830054)



研究论文

GP78基因多态性与冠心病相关

查额尔敦巴特，付真彦*，董春岚，王 蓓，黄 定

(新疆医科大学 第一附属医院 心脏中心 冠心病科, 新疆 乌鲁木齐 830054)

目的探讨GP78基因多态性与冠心病的相关性。方法TaqMan SNP 基因分型法对1109例(557例冠心病患者+552例对照者) 无血缘关系的研究对象进行基因分型，并应用病例对照的研究方法进行相关性分析。结果GP78基因rs2617849位点的基因分型和等位基因频率在冠心病组和对照组之间的分布存在明显差异(P<0.05)，冠心病组携带 TT 基因型(TT vs CC+CT)和T等位基因高于对照组(P<0.05)，在排除吸烟、高血压、糖尿病和低密度脂蛋白胆固醇等混杂因素后，仍存在显著性差异 (95% CI：1.035 ～ 1.736，P<0.05)。结论GP78基因的rs2617849位点多态性与冠心病相关，rs2617849的TT基因型和T等位基因可作为冠心病易感基因标记。

GP78;单核苷酸多态性；病例对照；冠心病

冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前病死率最高的疾病之一, 其形成主要是由于炎性反应、血脂代谢紊乱等导致血管内皮失去完整性,血管硬化、狭窄,使心肌供血不足。低密度脂蛋白胆固醇长期沉积于血管内引起冠状动脉粥样硬化，最终导致血液供应不足而产生心肌梗死[1]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)催化HMG-CoA生成甲羟戊酸(Mevalonate)，是胆固醇合成途径中关键的限速步骤，它在转录和蛋白水平受甾醇的负反馈调控，其中甾醇促进的HMGCR蛋白酶体降解是胆固醇合成途径关键的反馈调控步[2]。甾醇调节元件结合蛋(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)途径是胆固醇合成的另一个重要途径[3]。通过免疫共沉淀联合质谱的实验方法, 鉴定出介导HMGCR泛素蛋白酶体降解途径的泛素连接酶是GP78[2]。 GP78响应胞内不同的代谢信号, 分别介导HMGCR和Insig-1蛋白的快速降解来参与上述两个胆固醇合成的重要途径从而精确地调控胆固醇的合成速率。其在胆固醇的生物合成调节中起着很重要的作用。本研究的目的就是应用病例对照的研究方法研究GP78基因多态性与冠心病的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与对象

1.1.1 研究对象：557例冠心病患者。552例对照者。研究对象间无血缘关系，为2006年1月至2013 年1月在新疆医科大学第一附属医院收集。冠心病患者的入选标准为: 采用Judkin法行冠脉造影证实至少有1支血管的狭窄程度≥50%。对照组入选标准: 心电图排除冠心病或冠脉造影阴性;无心绞痛、冠心病史。对照组人群并非完全健康人群，他们当中有些人也有冠心病的危险因素，如高血压、糖尿病、高脂血症，但是没有心肌梗死病史，改良 Rankin 量表评分均为0分。所有的研究对象都收集了糖尿病、高血压和吸烟等冠心病传统危险因素相关的数据和信息。排除标准：肝、肾功能不全者; 肿瘤患者;本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准并获得了研究对象的知情同意。

1.1.2 试剂:TaqMan Universal PCR master Mix试剂盒(含dNTP PCR缓冲液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶)和SNP Genotyping Product试剂盒(含引物和探针)(ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取: 照常规酚-氯仿抽提法提取上述病例及对照外周血白细胞的 DNA，稀释 DNA 样本并用紫外可见分光光度计检测 DNA 浓度，保证各DNA样本浓度基本一致。

1.2.2 选择SNP位点：登陆人类Hap-Map计划数据库查找标签 SNP(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP),如果设置条件为r2≥0.5,最小基因频率(MAF)≤ 0.1我们获得了GP78基因标签SNP，rs2617849。

1.2.3 TaqMan法检测SNP SNP位点采用TaqMan SNP分型技术(AB7900HT实时定量荧光PCR仪) 进行基因分型。PCR反应体积为5 μL，内含2×TaqMan Master Mix 2.5μL、40×探针0.1 μL、dH2O 1.7 μL、模板DNA(40 mg/L)0.7 μL。反应条件：95 ℃ 10 min预变性,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min(40循环)。

1.2.4 生化检查:血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、三酰甘油、尿素氮等均由新疆医科大学第一附属临床检验中心检测。

1.3 统计学分析

2 结果

冠心病组的体质指数、空腹血糖和低密度脂蛋白胆固醇均高于对照组(P<0.01); 高血压、糖尿病的患病率(P<0.01)和吸烟率(P<0.05)也高于对照组(表1)。

rs2617849的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，rs2617849的基因分型和等位基因频率在冠心病和对照组的分布存在差异(P<0.05)，冠心病组的TT基因型和T等位基因均高于对照组(P<0.05)(表2)。

多元回归分析：因为高血压、糖尿病和吸烟是冠心病的3 个主要危险因素，在排除这3个危险因素之后，冠心病组(rs2617849) 的TT基因型仍然高于对照组(P<0.05)(表3)。

3 讨论

高胆固醇是引起冠心病的主要危险因素之一[4]。SREBP通路与HMGCR降解通路是胆固醇合成过程中两个主要的负反馈调控机制[5]。甾醇诱导的HMGCR降解是通过泛素(ubiquitin)蛋白酶体途径完成的。介导HMGCR泛素蛋白酶体降解途径的泛素连接酶是GP78。当细胞内胆固醇水平升高时,Insig结合HMGCR, 同时还结合GP78。GP78催化HMGCR在89位与248位赖氨酸残基的泛素化[2]。泛素化的HMGCR被迅速递送到蛋白酶体进行降解, 从而降低细胞内合成胆固醇的速率。GP78参与了两个相反的生物过程。一方面, GP78可以催化HMGCR泛素化使其快速降解。由于HMGCR是胆固醇生物合成过程中的限速酶，其降解后导致胆固醇合成下降[2,6-8]。另一方面, GP78也参与了Insig-1的泛素化-蛋白酶体降解途径[9]。Insig-1是SREBP成熟剪切过程中的负调控因子[10- 12]。如果快速降解Insig- 1, 就可以解除对SREBP通路的抑制, 激活其下游靶基因的表达, 从而上调脂质合成。净效果是肝脏胆固醇和脂肪酸的生物合成增加[13]。由此可推断GP78促使胆固醇的合成增加，相应的冠心病发病风险也增加。

表1 研究对象的临床资料特征Table 1 Characteristics of study participants

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

表2 冠心病组和对照组基因型和等位基因分布Table 2 Genotype and allele distribution of CHD and control groupe

*P<0.05 compared with control group.

表3 多元回归分析Table 3 Logestic regression

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

本研究发现，GP78基因rs2617849的基因型和等位基因频率在冠心病组和对照组之间的分布存在明显的差异，这表明携带 TT基因型(rs2617849)的人群发生冠心病的风险增加，虽然 rs2617849位于GP78基因的内含子没有功能,但是它可能和邻近有功能的SNP紧密连锁组成不同的单体型,潜在影响GP78 酶的结构和活性,携带 TT基因型和T等位基因(rs2617849)的人群可能具有较强的合成胆固醇的能力，而胆固醇是导致冠状动脉粥样硬化的重要因素，故冠心病的发病增加，rs2617849 的TT 基因型和T等位基因可作为冠心病的易感基因标记。

总之，本研究证实GP78基因的rs2617849位点多态性与冠心病相关，从遗传流行病学角度认为rs2617849位点的TT基因型和T等位基因作为冠心病易感基因标记，但是冠心病是多基因遗传与多环境因素共同作用的慢性疾病[14],故冠心病发病仍存在环境等因素的干扰，由于本研究样本量小，结果可能存在一定的局限性，还需要大样本量的研究更进一步证实上述结果，并能从基因功能方面进一步阐述GP78基因与冠心病的相关性。

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GP78 gene polymorphism is associated with coronary heart disease

CHA Erdenbat，FU Zhen-yan*, DONG Chun-lan, WANG Bei, HUANG Ding

(Heart Center，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Objective To evaluate potential association between humanGP78 gene and coronary heart disease(CHD). Methods The genotype was analyzed with by a Real-time PCR instrument in CHD group (n=557) and control group(n=552).The data were evaluated via case control study. Results The distribution of rs2617849 genotype and allele frequency showed significant difference between CHD and control subjects(P<0.05),the distribution of the TT genotype and T allele was significantly higher in CHD patients than control subjects(P<0.05).The significance of the TT genotype between CHD patients and control subjects retained after adjustment for covariates (95% CI: 1.035 ～1.736，P<0.05). Conclusions rs2617849 polymorphism is closely associated with CHD，TT genotype and T allele of rs2617849 functions as a genetic marker of CHD．

GP78; single nucleotide polymorphism; case-control study; coronary heart disease

2014- 08- 14

2014- 12- 02

国家自然科学基金(81260041)；新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2013911111)

1001-6325(2015)04-0450-04

R541.4

A

*通信作者(corresponding author)：fuzhenyan316@126.com