NO调节在小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟中的作用

高风兰，相淑芳，郑月慧，肖秋香，郑莉萍，吴 磊

(滨州市人民医院 1.肾内科； 2.产科， 山东 滨州 256600； 3.南昌大学 医学院 生殖研究室， 江西 南昌 330006)



研究论文

NO调节在小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟中的作用

高风兰1，相淑芳2，郑月慧3*，肖秋香3，郑莉萍3，吴 磊3

(滨州市人民医院 1.肾内科； 2.产科， 山东 滨州 256600； 3.南昌大学 医学院 生殖研究室， 江西 南昌 330006)

目的观察不同浓度硝普钠(SNP)、左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)对小鼠生发泡(GV)期卵母细胞体外成熟的影响。方法给小鼠腹腔注射PMSG 8IU，取其双侧卵巢，用卵母细胞体外培养法，分为L-NAME组、SNP+dbcAMP+L-NAME组、P+dbcAMP+SNP+L-NAME组，在倒置生物显微镜下观察卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率及第一极体(PB1)排出率。结果SNP+dbcAMP组的GVBD率与PB1率分别为(52.5±0.4与32.5±0.1)显著高于dbcAMP组的(28.0±0.2与11.1±0.7)(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP+L-NAME组的GVBD率与PB1率分别为(62.8±0.3与20±1.4)显著低于P+dbcAMP+SNP组的(90.1±1.3与66.6±0.9)，GVBD率与PB1率显著性降低(P<0.05)。 结论L-NAME与二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)抑制小鼠卵母细胞成熟时，小剂量NO呈现促进作用，这种促进作用在孕酮(P)存在时进一步加强。

一氧化氮;卵母细胞;L-NAME;dbcAMP;孕酮

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种信使分子，生物作用广泛。在某些肾脏疾病中，NO作为一种强有力的致病因素，可引起急性炎性反应。那么同时，NO对生殖系统有何影响，近年来研究发现NO也参与卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵等卵巢生理活动。鼠、猪、牛等哺乳动物的卵巢中都有NO合成酶的表达，提示NO参与卵巢的各种功能。目前认为NO对卵母细胞的成熟呈双向调节作用，小剂量NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)促进卵母细胞成熟，大剂量NO抑制卵母细胞成熟[1- 2]。本研究通过观察不同浓度NO与dbcAMP 或/和孕酮 共同作用下卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率及第一极体(first polar body,PB1)排出率变化，来探究对其体外成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：孕马血清促性腺激素(PMSG)(天津市华孚高新生物技术公司)M199、SNP、左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)、dbcAMP、孕酮(Sigma公司)。

1.1.2 动物：清洁级雌性昆明小鼠，3～4周龄(15～18 g)(南昌大学实验动物科学部，合格证号0229537)。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的获取与分组处理：给小鼠腹腔注射PMSG (8 IU/只)诱导超排卵，44～48 h后断头处死，取双侧卵巢，在体视显微镜下用4号针头小心剔除卵巢周围组织，刺破卵泡，释放出卵母细胞复合体(cumulus cell-enclosed oocyte,CEO)。口吸管吸取形态完好的生发泡(germinal vesicle,GV)期CEO，反复漂洗3次，移入每孔装有950 μL培养液，并加入不同处理因素的4孔培养板内，每孔35～70个左右卵母细胞，分为SNP组、L-NAME组、SNP+dbcAMP+L-NAME组、P+dbcAMP+SNP+L-NAME组，在37℃、5% CO2、95%空气、100%湿度的培养箱内培养12 h。

1.2.2 成熟度测定:在倒置生物显微镜下观察卵母细胞的成熟，包括细胞质和细胞核的成熟，分别对应为GVBD发生和PB1排出。每组试验重复3次，分别计算GVBD发生百分率平均值和PB1排出百分率平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠卵母细胞成熟过程中的形态学变化

刚分离出未成熟的卵母细胞，可见细胞内有一大核，称为GV，体外培养4 h后卵母细胞出现了GVBD，体外培养8 h后卵母细胞，出现了PB1(图1)。

2.2 SNP、孕酮、dbcAMP、L-NAME对GV期卵母细胞体外成熟的影响

2.2.1 小剂量SNP对卵母细胞体外成熟的影响:不同剂量SNP对GVBD率与PB1排出率均无明显影响(表1)。

2.2.2 L-NAME对卵母细胞体外成熟的影响： 1×10-2和1×10-3mol/L L-NAME组，卵母细胞6 h GVBD率和12 h PB1率均较对照组显著降低(P<0.05)，GVBD率比对照组低27%和28.1%，PB1率低23.8%和20.3%(表2，3)。

A .immature oocyte containing GV； B.oocyte with GVBD；C.oocyte and the extrused PB1

groupCEO(n)GVBD%PB1%control64±4723±08296±12SNP(1×10-4mol/L)62±3747±06323±01SNP(1×10-5mol/L)67±3696±00326±03SNP(1×10-6mol/L)60±5725±08300±08

表2 L-NAME对卵母细胞成熟过程中GVBD的影响Table 2 The effect L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

2.2.3 SNP、dbcAMP、L-NAME对卵母细胞体外成熟的影响: SNP+dbcAMP组卵母细胞6 h GVBD率与12 h PB1率较dbcAMP组显著升高(P<0.05)(GVBD率升高24.5%，PB1率升高21.4%)。SNP+dbcAMP+L-NAME组6 h GVBD率与12 h PB1率较SNP+dbcAMP组均有显著降低(P<0.05)，(GVBD率降低41.1%，PB1率降低19.2%)(表4,5)。

2.2.4 孕酮、dbcAMP、SNP、L-NAME对卵母细胞体外成熟的影响:P+dbcAMP组卵母细胞6 h GVBD率与12 h PB1率较dbcAMP组均有显著性升高(GVBD率升高39.7%，PB1率升高21.6%)(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP组与P+dbcAMP组比较，卵母细胞6 h GVBD率升高21.7%、12 h PB1率升高33.9%(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP+L-NAME组与P+dbcAMP+SNP比较，卵母细胞6 h GVBD率降低27.3%、12 h PB1率降低46.6%(P<0.05)(表6,7)。

表3 L-NAME对卵母细胞体外成熟过程中PB1的影响Table 3 The effect L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

表4 SNP、dbcAMP、L-NAME对卵母细胞GVBD的影响Table 4 The effect of SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05 compared with dbcAMP group；**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with dbcAMP+SNP group.

表5 SNP、dbcAMP、L-NAME对卵母细胞PB1的影响Table 5 The effect of SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05 compared with dbcAMP group；**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with dbcAMP+SNP group.

表6 P、SNP、dbcAMP、L-NAME对卵母细胞GVBD的影响Table 6 The effect of P,SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05 compared with P+dbcAMP group；**P<0.01 compared with dbcAMP group；#P<0.05 compared with P+dbcAMP+SNP group.

表7 P、SNP、dbcAMP、L-NAME对卵母细胞PB1率的影响Table 7 The effect of P,SNP,dbcAMP,、L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05 compared with P+dbcAMP group；**P<0.01 compared with dbcAMP group；#P<0.05 compared with P+dbcAMP+SNP group.

3 讨论

NO是调节生殖功能的重要信号因子之一，参与卵母细胞成熟、受精及胚胎发育多种生理活动[3]。生理状态下，卵巢合成的NO对卵母细胞的成熟起促进作用[4- 5]。对于小鼠复合卵母细胞体外自发成熟，NO呈现双向调节作用，小剂量的NO促进CEO成熟，大剂量的NO对CEO与裸卵体外成熟都有抑制作用[2，4- 6]。以前的大多数研究集中于大剂量NO对卵母细胞体外成熟，而小剂量NO对卵母细胞体外成熟影响，有学者进行研究[1- 2,7]。对其作用形式进行了探讨，但迄今对其作用机制还不明了。本实验证实了小剂量NO促进卵母细胞成熟，虽然单独给予小剂量SNP，对卵母细胞的成熟并没造成影响。但应用NOS的抑制剂L-NAME时，阻断了卵母细胞及颗粒细胞合成NO，使卵母细胞的成熟收到明显的抑制。复合卵母细胞本身产生的NO在卵母细胞的成熟过程中，发挥关键性的作用。

卵泡液中存在孕酮、NO等促进卵母细胞成熟的因子和cAMP、次黄嘌呤(HX)等抑制卵母细胞成熟的因子，正是这些因子的共同作用使卵母细胞正常发育成熟。模仿卵泡内液，向培养液中添加dbcAMP,使卵母细胞内的cAMP水平升高，则卵母细胞的成熟受到抑制，小剂量SNP(1×10-4～1×10-6mol/L)可以消除dbcAMP对卵母细胞成熟的抑制作用，L-NAME减弱SNP对dbcAMP的消除作用，这说明存在抑制因素的条件下，卵母细胞生成的内源性NO发挥促进卵母细胞成熟的作用。

孕酮(1×10-6mol/L)能够消除dbcAMP对卵母细胞成熟的抑制作用，SNP与孕酮起协同消除作用。这表明NO除了通过与孕酮相同的cAMP-PKA途径，还存在其他不同于孕酮的途径如cGMP途径等促进卵母细胞成熟[7- 8]。其分子机制须待下一步实验中研究。

综上所述，NO抑制剂和供体影响卵母细胞成熟、排卵、胚胎的发育，一些狼疮性肾炎、子宫内膜异位症[9]等引起不孕的卵泡内液中NO浓度也增高,卵母细胞成熟度差。如果能揭示NO在卵巢的作用机制，将对不孕症的治疗和计划生育避孕药提供新的思路。

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The effect of NO on meiotic maturation of immature mouse oocytesinvitro

GAO Feng-lan1, XIANG Shu-fang2, ZHENG Yue-hui3*, XIAO Qiu-xiang3, ZHENG Li-ping3, WU Lei3

(1.Dept. of Nephrology; 2.Dept. of Obstetrics, Binzhou People Hopital, Binzhou 256600; 3.Dept. of Repruduction, Medical School, Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To study the influence of different doses of Sodium nitroprusside and NW-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on maturation of germinal vesicle stage oocyteinvitro. Methods We used exogenous PMSG to induce mouse superovulate and then took hibateral ovaries. This research consisted of L-NAME group,SNP+dbcAMP+L-NAME group,P+dbcAMP+SNP+L-NAME group. oocyte maturation rate(GVBD percentage,PB1rate) was examined by microscopy.Results Compared with dbcAMP (28±0.2,11.1±0.7) group, the SNP+dbcAMP group GVBD percentage and PB1 rate(52.5±0.4and32.5±0.1)significantly increased (P<0.05). Compared with P+dbcAMP + SNP group(90.1±1.3and 66.6±0.9), the P+dbcAMP+SNP+L-NAME group oocyte GVBD percentage and PB1 rate(62.8±0.3 and 20±1.4) significantly decreased(P<0.05).Conclusions When dbcAMP and L-NAME suppress mouse oocyte maturation, low concentration of NO shows promoting effect, progesterone(P) can enforce this promoting effect.

nitric oxide; oocyte; L-NAME; dbcAMP; progesterone

2014- 09- 05

2015- 01- 04

国家自然科学基金(30260035)

1001-6325(2015)04-0475-05

R-332

A

*通信作者(corresponding author)：：zhengyuehui@163.com