肝素粗品提取新工艺研究

杨涛，万端极，*，吴正奇，邹华荣，马超

（1.湖北工业大学资源与环境工程学院，湖北武汉430068；2.湖北工业大学食品与制药工程学院，湖北武汉430068）

肝素粗品提取新工艺研究

杨涛1，万端极1，*，吴正奇2，邹华荣1，马超1

（1.湖北工业大学资源与环境工程学院，湖北武汉430068；2.湖北工业大学食品与制药工程学院，湖北武汉430068）

以猪小肠黏膜酶解液为原料，通过酸碱与沉淀剂A对原料除杂，然后直接醇沉肝素粗品。原料以除杂率和总效价为指标，优化出碱除杂的pH为11.0、酸除杂的pH为3.0；以除杂率为指标，并采用响应面法优化沉淀剂A的沉淀条件：沉淀剂A的用量为0.34%、pH为7.3和温度为30.0℃。再用乙醇沉淀，干燥后得到效价为106 U/mg的肝素粗品。与传统工艺相比，肝素粗品的纯度至少提高5.66%，肝素损失率从22.15%降至14.60%。

肝素；效价；除杂

肝素是一种广泛存在于动物各组织内的黏多糖，为白色或类白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸酯，分子量分布在6 000～20 000 Da，是一种天然抗凝血物质，被广泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇等作用[1-3]。

目前国内提取肝素的工艺较多，主要以离子交换为主，该工艺繁琐，耗时长，肝素损失率高[4]。本文在猪小肠黏膜充分酶解的基础上，通过强化前期除杂，对除杂液直接乙醇沉淀肝素粗品，简便工艺，降低生产成本，降低肝素损失率。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

新鲜猪小肠粘膜由武汉市肉联厂购得；复合蛋白酶（0.56 mka/g）：北京普诺信达科技有限公司；肝素钠标准品（198 U/mg）：中国药品生物制品鉴定所；绵羊血浆：山东苍山向明生化助剂厂；沉淀剂A：湖北工业大学膜技术研究所；盐酸、氢氧化钠、氯化钠、95%乙醇：均为AR；HH-2数显恒温水浴锅：上海嘉程仪器设备厂；DZX-6000B真空干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；JJ-1增力电动搅拌器：上海赛康科技电器有限公司；PHS-4pH酸度计：上海伟业仪器厂；WFZ800-D3B型可见紫外分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；RE-52冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 检测与评定方法

1.2.1 肝素效价测定

绵羊血浆法[5]，计量单位用美国药典单位（USP）表示[6]。

1.2.2 总氮含量测定

微量凯氏定氮法。

1.2.3 P含量测定

微量定磷法[7]。

1.2.4 除杂效果评定，采用除杂率为指标：

式中：P1为除杂前的磷含量，（mg/mL）；P2为除杂后的磷含量，（mg/mL）；N1为除杂前的氮含量，%；N2为除杂后的氮含量，%。

1.3 肝素提取工艺流程

猪小肠黏膜酶解液[8]→碱除杂→酸除杂→沉淀剂A除杂→乙醇沉淀→干燥→肝素粗品

1.4 猪小肠黏膜酶解液纯化工艺研究

1.4.1 碱除杂pH的选择

准确量取6份猪小肠黏膜酶解液各100 mL，分别调pH为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5，置于5℃的环境中，60 r/min搅拌20 min，低温离心，4 000 r/min离心20 min，取上清液检测。以每份上清液总效价和除杂率为指标，记录实验数据。分析不同pH对肝素总效价和除杂率的影响，确定碱除杂的最适pH。

1.4.2 酸除杂pH的选择

准确量取6份1.4.1处理液各100 mL，分别调pH为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，置于5℃的环境中，60 r/min搅拌20 min，低温离心，4 000 r/min离心20 min，取上清液检测。以每份上清液总效价和除杂率为指标，记录实验数据。分析不同pH对肝素总效价和除杂率的影响，确定酸除杂的最适pH。

1.4.3 响应面法优化沉淀剂A除杂条件

采用中心组合实验Box-Behnken设计方案，分别用A、B、C来表示沉淀剂的用量（%）、反应pH、反应温度（℃），并以+1、0、-1分别代表变量水平，实验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 碱除杂pH对除杂率与总效价的影响

碱除杂pH对除杂率与总效价的影响见图1。

图1 碱除杂pH对除杂率与总效价的影响Fig.1 Alkali removing impurity of pH for removing impurity effect and the influence of heparin activity

图1表明，随着pH的升高，除杂率呈增加趋势，肝素的总效价呈下降趋势。由于小肠粘膜酶解后还会存在一些蛋白，当pH调至相应等电点时，可除去部分含N物质；过高的pH会使肝素的一些化学键破坏，使肝素的活性降低。从图1可以看出当pH大于11.0时，除杂率趋于稳定，同时总效价持续下降，由此可以确定碱除杂的最适pH为11.0。

2.2 酸除杂pH对除杂率与总效价的影响

酸除杂pH对除杂率与总效价的影响见图2。

图2 酸除杂pH对除杂率与总效价的影响Fig.2 Acid removing impurity of pH for removing impurity effect and the influence of heparin activity

图2表明，随着pH的升高，除杂率呈下降的趋势，肝素的总效价呈上升降趋势。部分含N物质在酸性环境下被除去；部分含P物质也会在低pH下沉淀。过低的pH会使肝素的氮硫酸基破坏，使肝素的活性降低。从图2可以看出当pH小于3.0时，除杂率稳定上升，总效价迅速降低，由此可以确定酸除杂的最适pH为3.0。

2.3 沉淀剂A除杂条件的响应面法优化

2.3.1 模型的建立与显著性检验

利用Design-expert软件对试验数据进行多元回归拟合。可得到杂质去除率（Y）对沉淀剂用量（A）、pH（B）与温度（C）的二元多次回归模型为：

Y=9.67+0.51A-0.17B+0.027C-0.5AB-0.085AC+ 0.7BC-1.18A2-0.76B2-0.2C2

回归模型的方差分析结果见表2。

表2 回归模型的方差分析结果Table 2Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

从表2中可以看出失拟项不显著（p=0.122 7> 0.05），而模型的p值<0.01，表明模型极显著；同时软件分析的复相关系数R2=0.971 2，校正后的R2Adj=0.934 1，这表明该模型的拟合程度良好，试验误差小，故可以用此模型来分析和预测沉淀剂A除杂率。

2.3.2 响应面优化

根据回归线方程，作出响应面，考察拟合响应曲面的形状，以杂质的去除率最大为指标进行优化，分析沉淀剂用量、pH和温度对除杂率的影响。响应面的形状如图3～图5所示。

图3 沉淀剂用量与pH的响应曲面Fig.3 Response surface of Y=（A，B）

通过Design-expert软件分析，得到沉淀剂A除杂的最优工艺条件为：沉淀剂A的用量为0.34%，pH为7.3与温度为30.0℃，在此条件下，除杂率预测值为9.87%。进行3次验证性实验，结果除杂率分别为9.80%，9.78%与9.95%，平均值为9.84%，比预测理论值低0.03%。因此，响应面法所得到的优化工艺条件准确可靠，具有实用价值。

图4 沉淀剂用量与温度的响应曲面Fig.4 Response surface of Y=（A，C）

图5 pH与温度的响应曲面Fig.5 Response surface of Y=（B，C）

2.4 工艺结果分析

传统的作坊式生产的肝素粗品效价基本在80U/mg～100 U/mg；肝素损失率在22.15%左右。采用本工艺处理，干燥后的产品效价可达106 U/mg，其纯度至少提高5.66%；工艺过程中肝素损失率降至14.60%左右。

3 结论

本工艺在对原料纯化时，以肝素总效价和除杂率为指标，通过实验优化得：碱除杂的最适pH为11.0；酸除杂的最适pH为3.0。以除杂率为指标，通过响应面法优化得到沉淀剂A除杂的最优条件：沉淀剂A的用量为0.34%、pH为7.3和温度为30.0℃。经除杂后的液体采用乙醇直接沉淀，干燥后可得到106 U/mg的肝素粗品，其纯度至少提高5.66%，肝素损失率从22.15%降至14.60%。本工艺除杂后的溶液为澄清透明，具有较好的流动性，为后续分离纯化工艺提供了更多选择；同时本工艺还可以对除杂沉淀物与沉淀肝素后的溶液进行联产蛋白与多肽等产品，增加附加值。与传统工艺相比，本工艺具有：肝素损失率低、工艺简便和生产成本低等优点。

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[2]陈自然.从猪小肠黏膜中提取肝素钠的生产技术改进[J].川北教育学院学报,2001,11(1):55-57

[3]Weitz J,Hirsh J.New anticoagulant strategies[J].J Lab Clin Med, 1993,122(4):364-373

[4]王国栋,杨佳艺,杨佳,等.肝素提取纯化技术研究进展[J].食品工业科技,2012,33(9):436-440

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[6]USPInc.US pharmacopeia National Formulary XXⅢ[M].Rockville, MD,Published by USPInc,2011:776-778

[7]陈庆森,庞光昌,吴子健.实用生物化学实验技术指导[M].天津:天津科学技术出版社,2006:83-85

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Research on the New Method of Extraction Crude Heparin

YANG Tao1，WAN Duan-ji1，*，WU Zheng-qi2，ZOU Hua-rong1，MA Chao1
（1.Hubei University of Technology School of Resources and Environmental Engineering，Wuhan 430068，Hubei，China；2.Hubei University of Technology School of Food and Pharmaceutical Engineering，Wuhan 430068，Hubei，China）

This study explored a new method.Adopting different pH and using precipitant A to remove the impurities.Then，crude heparin was precipitated by ethanol.Porcine intestinal mucosa hydrolyzate as feedstock，regard the rate of removed impurities and the total of titer as an indicator，optimization of the alkaline pH of 11.0，acid pH of 3.0.Regard the rate of removed impurities as an indicator，using response surface methodology to optimize the precipitation conditions.Determining precipitation reaction conditions are that precipitant agent A dosage 0.34%，pH7.3 and the temperature 30.0℃.The dry of crude heparin is 106U/mg.In the course of preparation of heparin，The purity of crude heparin enhanced at least 5.66%，the rate of loss dropped 22.15%to 14.60%.

heparin；titer；remove impurities

2013-09-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.012

贵州省科技计划项目（黔科合SY字[2013]3014]）

*通信作者