四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠二肽基肽酶4活性变化

税迎春，夏欣一，章 琼，张 承，吴元赭

·论 著·

四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠二肽基肽酶4活性变化

税迎春1，夏欣一2，章 琼1，张 承1，吴元赭1

目的 观察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠体内二肽基肽酶4（DPP4）酶活性变化。方法 建立四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型，检测大鼠血浆及部分组织中DPP4酶活性变化，同时检测血浆总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、胰岛素和活性胰高血糖素样肽⁃1（GLP⁃1）水平变化。结果 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰岛素耐量显著异常。血浆、肺、肝和回肠DPP4活性显著升高，其吸光度值分别由（0．10±0．01）、（0．16±0．02）、（0．15±0．01）和（0．17±0．01）升高到（0．20±0．04）、（0．18± 0．03）、（0．19±0．02）和（0．19±0．02）。血浆胰岛素和活性GLP⁃1水平显著降低，分别由（1．22±0．41）ng／L和（3．11±1．20）pmol／L下降到（0．71±0．31）ng／L（P＜0．01）和（2．03±0．93）pmol／L（P＜0．05），而血浆TC和TG水平显著升高，分别由（3．23± 0．62）mmol／L和（1．01±0．10）mmol／L升高到（5．32±1．41）mmol／L（P＜0．01）和（1．83±0．41）mmol／L（P＜0．01）。结论 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰岛素耐量显著异常，血脂升高，胰岛素降低，血浆及部分组织DPP4酶活性升高，从而导致血浆活性GLP⁃1水平下降。

四氧嘧啶；糖尿病妊娠大鼠；二肽基肽酶4；活性GLP⁃1；胰岛素

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）是目前糖尿病药物开发中最热门的靶点之一，目前已有多个DPP4抑制剂上市，用于糖尿病的治疗，效果十分显著。四氧嘧啶（alloxan，ALX）糖尿病大鼠模型是目前糖尿病研究中广泛应用的动物模型之一，对此模型的特征及其发病机制也已有许多研究报道。目前国内外尚未见有关于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠体内DPP4酶活性的研究报道。本研究观察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠体内DPP4酶活性变化情况，以进一步了解四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物学特征。

1 材料与方法

1.1 试剂 四氧嘧啶、甘氨酸对硝基苯胺（gly⁃Pro⁃p⁃nitroanilide）和Hepes缓冲液购自Sigma公司。血糖、三酰甘油（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度胆固醇（high⁃density lipo⁃protein cholesterol，HDL⁃C）、低密度胆固醇（low den⁃sity lipoprotein cholesterol，LDL⁃C）和糖化血红蛋白（haemoglobin A1C，HbA1c）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。大鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒为ALPCO公司产品。活性GLP⁃1（glucagon like peptide⁃1）ELISA试剂盒购自Millipore公司。葡萄糖等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 μ⁃Quant酶标仪为美国Bio⁃Tek公司产品，3⁃18k离心机为德国Sigma公司产品。

1.3 实验动物 SPF级WISTAR大鼠，体重250g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK（京）2002⁃0003。所有动物均饲养于SPF级动物房。

1.4 实验方法

1.4.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型建立 WISTAR大鼠28只，禁食（不禁水）12 h后，按70 mg／kg体重尾静脉注射四氧嘧啶，6 d后测空腹血糖，以血糖值14～ 26 mmol／L为糖尿病大鼠。

1.4.2 口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT） 动物禁食4 h后，进行口服葡萄糖耐量试验［1］。测定空腹血糖（0 min）及葡萄糖（2．0 g／kg）负荷后30、60和120 min时的血糖值，并计算血糖曲线下面积（AUC）。

1.4.3 胰岛素耐量试验（insulin tolerance test，ITT） 进行OGTT 1周后，动物禁食4 h，皮下注射常规胰岛素溶液（0．4 U／kg）［1］。于注射前（0 min）和注射后40、90 min采血样，测定各时间点的血糖值，并计算血糖曲线下面积（AUC）。

1.4.4 血浆DPP4活性测定 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠禁食4 h，尾尖采血样，室温放置30 min后，6000×g离心1 min。反应底物甘氨酸对硝基苯胺工作液用Hepes缓冲液（pH 7．05）配制，浓度为0．30 mmol／L。取10 μL血浆，加入40 μL底物工作液和50 μL Tris／HCl缓冲液（pH 8．0）。在37℃条件下，检测反应60 min内波长405 nm吸光度值的变化［2］。

1.4.5 组织DPP4酶活性测定 －80℃保存的组织样品于冰上融化。称取0．1 g组织，加于500 μl Tris／HCl缓冲液（pH 8．0）中剪碎，200 w，10 s／次，2次，超声粉碎。然后于4℃，12 000×g离心10 min。取上清，再于12 000×g离心20 min。获取上清用于测定。采用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度。选择Tris／HCl缓冲液（pH 8．0）稀释上清，使各样品蛋白浓度一致。取10 μL稀释上清，加入40 μL底物工作液（浓度为0．30 mmol／L）和50 μL Tris／HCl缓冲液（pH 8．0）。在37℃条件下检测反应60 min内 405 nm处吸光度的变化［2］。

1.4.6 血浆TC、TG、胰岛素和活性GLP⁃1水平测定 按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13．0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用t检验，所有数据经正态性和方差齐性检验，采用多因素方差分析方法分析，以P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠OGTT变化 与正常对照大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠空腹血糖值（0 min）显著升高，升高达283．4%（P＜0．01）。口服糖负荷后，30、60和120 min血糖值也显著升高（P＜0．01），且OGTT曲线下面积（AUC）也显著升高（P＜0．01）。表明四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量显著异常。

2.2 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠ITT变化 正常大鼠皮下注射胰岛素后，血糖下降十分显著，并且血糖恢复也比较迅速，而四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠皮下注射胰岛素后，血糖变化并不显著，提示四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠胰岛素耐量显著异常。

表1 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠OGTT结果

表2 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠ITT结果

2.3 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆及部分组织DPP4活性变化 与正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆DPP4活性显著升高，升高达100．0%（P＜0．01），同时四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠肺、肝和回肠组织中DPP4活性也显著升高，分别升高了12．5%（P＜0．05）、26．7%（P＜0．01）和11．7%（P＜0．05）。

表3 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠血浆及部分组织DPP4活性变化（吸光度值）

2.4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆胰岛素、活性GLP⁃1、TC和TG水平变化 与正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆胰岛素和活性GLP⁃1水平显著降低，分别下降了41．8%（P＜0．01）和34．7%（P＜0．05），而TC和TG水平显著升高，分别升高了64．7%（P＜0．01）和81．2%（P＜0．01）。但HDL⁃C、LDL⁃C和HbA1c水平无明显变化。

表4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆胰岛素、活性GLP⁃1、TC和TG水平变化

3 讨 论

四氧嘧啶是胰岛β细胞毒剂，通过产生H2O2等超氧自由基，选择性不可逆地破坏胰岛β细胞，作用迅速而强烈，使胰岛分泌功能丧失，造成内分泌功能紊乱，糖、脂肪、蛋白质等的代谢失调，从而导致负氮平衡，使机体消瘦而体重下降，甚至引起动物死亡［3］。由四氧嘧啶诱导的动物糖尿病模型与人类1型即胰岛素依赖性糖尿病类似。四氧嘧啶价格低廉，造模成功率高，死亡率低，模型稳定，因此四氧嘧啶诱导的动物糖尿病模型在抗糖尿病及降血脂药物研发中应用十分广泛。

DPP4是多功能的以同源二聚体形式存在的高特异性丝氨酸蛋白酶，广泛分布于肝、肾、肠、脾脏、肾上腺等组织中，存在于许多类型细胞表面，包括淋巴细胞、上皮细胞和内皮细胞等。DPP4可以以膜结合型和可溶型2种形式存在，膜结合型DPP4被酶切后，即变为可溶型形式进入循环系统。DPP4可以剪切N端的第二位为丙氨酸或脯氨酸的多肽，体内很多活性多肽，如神经肽、趋化因子、细胞因子等都是DPP4的底物［4］。

肠促胰岛素在糖尿病发生发展中起重要作用。GLP⁃1为20世纪80年代发现的肠促胰岛素，摄食后由肠道L细胞分泌。GLP⁃1的主要作用包括刺激胰岛素生物合成和葡萄糖诱发的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，提高β细胞对血糖的反应，促进β细胞增殖并抑制其凋亡，延缓胃排空和减少肝糖输出等。研究表明GLP⁃1对妊娠期糖尿病患者的血糖和胰岛功能有改善作用［5⁃6］，但GLP⁃1极易被DPP4降解而失活，体内半衰期仅有2 min左右［7⁃8］。因此研究者试图直接补充或通过抑制DPP4活性来间接提高血液中GLP⁃1的量来治疗糖尿病［7⁃8］。

有关动物模型中DPP4活性的研究并不多。链脲菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的C57糖尿病大鼠、高脂加STZ共同诱导的WISTAR糖尿病大鼠、高脂或高果糖喂养的F334／Jcl大鼠的血浆DPP4活性均显著升高［9⁃11］。高脂和STZ联合诱导的SD糖尿病大鼠以及长期高脂喂养的SD大鼠的肠、肝脏和肾脏组织DPP4活性和表达均显著升高［12］。谷氨酸诱导的胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖正常，但血清、肝脏和回肠DPP4酶活性及含量均显著升高。有研究表明2型糖尿病患者体内DPP4活性显著升高［13］，但是也有研究显示2型糖尿病患者体内DPP4活性是降低的［14⁃15］。有研究指出高血糖并不是引起DPP4活性升高的诱发因素，糖耐量异常和胰岛素抵抗才可能对DPP4酶活性升高起重要作用［16⁃19］。

本研究发现，和正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠脂质代谢、糖耐量和胰岛素耐量显著异常，空腹血糖显著升高，表现出显著的1型糖尿病特征。四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆DPP4活性显著升高，同时肺脏、肝脏和回肠中DPP4活性也显著升高。由于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性升高，导致血浆中活性GLP⁃1降解加速，血浆中活性GLP⁃1浓度下降，进一步导致胰岛素分泌减少，血浆中胰岛素浓度下降，更进一步加重了大鼠糖尿病症状。本研究结果提示，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血浆及部分组织DPP4活性显著升高，血浆活性GLP⁃1及胰岛素水平显著下降。该结果为探讨妊娠糖尿病的致病机制提供了试验依据。下一步我们将对四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性显著升高的可能机制进行研究与探讨，以丰富四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物学特征。

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Changes of DPP4 enzyme activity in alloxan⁃induced diabetic pregnant rat

SHUI Ying⁃chun1，XIA Xin⁃yi2，ZHANG Qiong1，ZHANG Cheng1，WU Yuan⁃zhe1． 1．Department of Gynaecology，2．The People's Lib⁃eration Army Inspection Institute for Medical Research Nanjing，Nanjing General Hospital of Nanjing Mlitary Region，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective To study changes of DPP4 enzyme activity in alloxan induced diabetic pregnant rat．Methods Dia⁃betic rat were induced by alloxan，DPP4 enzyme activities of plasma and some tissues were determined．At the same time，the plasma insulin，TG，TC and active GLP⁃1 levels were also determined．Results There were obvious impaired glucose tolerance and insulin tolerance in alloxan induced diabetic pregnant rat．In alloxan induced diabetic pregnant rat，DPP4 enzyme activities of the plasma，lung，liver and ileum increased from（0．10±0．01），（0．16±0．02），（0．15±0．01）and（0．17±0．01）to（0．20±0．04），（0．18±0．03），（0．19±0．02）and（0．19±0．02），respectively．At the same time，plasma insulin and active GLP⁃1 levels declined from（1．22±0．41）ng／L and（3．11±1．20）pmol／L to（0．71±0．31，P＜0．01）ng／L and（2．03±0．93，P＜0．05）pmol／L respectively，but plasma TC and TG increased from（3．23±0．62）mmol／L and（1．01±0．10）mmol／L to（5．32±1．41，P＜0．01）mmol／L and（1．83±0．41，P＜0．01）mmol／L respectively．Conclusion In alloxan induced diabetic pregnant rat，glucose tolerance and insulin tolerance were abnormal sig⁃nificantly，accompanied with hyperlipidemia and hypoinsulinemia．DPP4 enzyme activities of the plasma and some tissues increased，then caused plasma active GLP⁃1 level decreased significantly．The results of the study can provide the experimental basis for the patho⁃genic mechanism of gestational diabetes mellitus research．

alloxan；diabetic pregnant rat；DPP4；active GLP⁃1；insulin

R587．1

A

10．3969／j．issn．1672⁃271X．2015．06．003

∶2015⁃08⁃19；

∶2015⁃08⁃27）

江苏省科技厅省级条件建设与民生科技专项基金（BM2013058）

210002江苏南京，南京军区南京总医院，1．妇产科，2．全军检验医学研究所

吴元赭，E⁃mail∶Wuzhe860103＠sina．com

（本文编辑∶齐 名； 英文编辑∶王建东）