适用于基因全长克隆的灰毡毛忍冬不同器官总RNA提取方法筛选

刘湘丹，徐玉琴，王 珊，童巧珍，周日宝*（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

·中药资源·

适用于基因全长克隆的灰毡毛忍冬不同器官总RNA提取方法筛选

刘湘丹，徐玉琴，王 珊，童巧珍，周日宝*
（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

目的获取灰毡毛忍冬不同器官总RNA的最佳提取方法。方法以灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾为材料，分别采用SDS法、Trizol法、改良CTAB法、多糖多酚试剂盒法提取总RNA，比较分析实验结果。结果SDS法不适用于三种器官样品总RNA的提取；Trizol法仅适用于叶总RNA的提取；改良CTAB法对茎总RNA提取效果最佳；而多糖多酚试剂盒法提取的花蕾总RNA质量高、完整性较好，且通过RT-PCR扩增能获得特异性条带。结论Trizol法最适于灰毡毛忍冬叶总RNA提取；改良CTAB法最适于茎总RNA提取；多糖多酚试剂盒法最适于花蕾总RNA提取；3种方法提取出来的总RNA均能满足灰毡毛忍冬中相关基因全长克隆及时空表达分析的要求。

灰毡毛忍冬；基因全长克隆；总RNA；不同器官；提取方法

对灰毡毛忍冬的研究主要集中在种植、化学成分、药理作用、药材加工种质资源等方面[5-6]，其分子生物学方面的研究甚少，亦未见灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾总RNA提取方法的研究。常用的总RNA提取方法有SDS法、Trizol法、CTAB法和试剂盒法。本文采用上述4种方法提取灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾总RNA，探索提取灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾总RNA的有效方法，为相关基因的全长克隆及其时空表达模式分析等试验提供优良材料，为该植物不同部位总RNA提取提供实验依据。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采自湖南中医药大学药植园，经湖南中医药大学中药资源教研室周日宝教授鉴定，为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬的叶、茎、花蕾。

1.2 试剂与仪器

Trizol提取液（Invitrogen公司）；多糖多酚试剂盒（BioFlus，浙江）；Thermo逆转录试剂盒；焦碳酸二乙酯 (DEPC)（Invitrogen公司）；琼脂糖(GENE COMPANYLTD)；DL2,000 DNA Marker(TaKaRa)；6×DNA Loading Buffer（北京索莱宝科技有限公司）；AGL19引物（上海生工）；ddH2O（TIANGEN，北京）；2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN，北京）。其他试剂均为分析纯。

TGL-18M高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；THA-3560 C高压灭菌锅 （造鑫企业有限公司）；HE-120 Gen多功能水平电泳槽（上海天能科技有限公司）；Tanon-GIS-1 000 B凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；Biophotometer 6 131核酸蛋白分析仪（德国eppendorf公司）；WD-9402APCR扩增仪（德国eppendorf公司）。

1.3 总RNA提取方法

1.3.1 SDS法 本方法参照王暑辉[7]的SDS法进行提取。收集液于-80℃保存备用。

穿过格斗笼拍摄是一个好主意，使这幅作品看起来尤为别致。网眼的清晰度处理的正合适，透过网眼，画面正确对焦在了Dylan的脸上。苛刻地说，如果这幅作品里能同时看到Carys的两条腿就更完美了。但“不完美”本就是拍摄动态场景的精髓所在，你几乎不可能完全掌控所有的元素，只能在机会出现的时候，尽可能地把握住它。虽然Craig自己还不太满意，但他已经做得很出色了！

1.3.2 Trizol法 分别称取新鲜叶、茎、花蕾各0.1 g，按Trizol使用说明书进行操作，最后得收集液各50 μL，-80℃保存备用。

1.3.3 改良CTAB法 在孟丽[8]的CTAB提取法上进行改良。步骤如下：准备3个1.5 mL离心管，分别加入 600 μL 2×CTAB提取液 （2%CTAB，2.0 mol/L NaCl，0.25 mol/L EDTA，1.0 mol/L Tris) 和15 μL β-巯基乙醇，65℃水浴15 min；分别称取新鲜茎、叶、花蕾各0.2 g左右，在液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中；室温12 000 r/min离心10 min，吸取上清液于离心管中，每管中加入等体积三氯甲烷，混合均匀，室温12 000 r/min离心10 min；吸取上清液于新离心管中，加入1/4体积8 mol/L LiCl，混匀，4℃沉淀过夜；4℃，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀，用500 μL SSTE溶液[1.0 mol/L NaCl，0.5% SDS，1.0 mol/L Tris-HCl （pH=8.0），0.25 mol/L EDTA]；溶解沉淀，洗去DNA及其他杂质；加入等体积酚/三氯甲烷（1:1），漩涡混匀，1.2万r/min，4℃离心10 min，再加入等体积酚/三氯甲烷（1:1），漩涡混匀，同样条件下离心，洗去上清，加入1/10体积3 mol/L NaCl和2倍体积无水乙醇，混匀，-70℃沉淀30 min；4℃，12 000 r/min离心20 min，弃上清液，用200 μL 70%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶于50 μL DEPC处理水中，-80℃保存备用。

1.3.4 多糖多酚试剂盒法 分别称取新鲜叶、茎、花蕾各0.1 g，按Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作，得50 μL收集液于-80℃保存备用。

1.4 总RNA质量检测

1.4.1 浓度及纯度测定 分别取2 μL RNA原液，用DEPC处理水稀释50倍，用核酸蛋白分析仪测定浓度及OD260/280，OD260/230。高质量、无污染的总RNA 其OD260/280应为1.8-2.0，OD260/230应大于2.0。

1.4.2 完整性检测 分别取5 μL RNA样品，加入1 μL上样缓冲液，在1%的非变性琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完成后于凝胶成像系统中成像，拍照记录。

1.4.3 RT-PCR检测 RT-PCR对RNA、cDNA的纯度和完整性都有较高要求，为进一步验证以上方法提取的总RNA的可用性，以提取得到的总RNA为模板，严格按照 TaKaRa PrimeScripttmⅡ 1st Strand cDNA Synthessis Kit试剂盒说明书，将总RNA逆转录成第一链cDNA。根据灰毡毛忍冬高通量测序结果中AGL19 Unigene序列应用Primer 5.0设计引物 AGL19-F：5’-ATG GTG AGG GGG AAA ACT CAG-3’；AGL19-R：5’-ACG CCT TTC GGG CAG TCC TAT G-3’ATC进行RT-PCR。PCR反应体系（25 μL）：cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL。PCR反应程序：94℃ 预变性 4 min；94℃变性45 s，56℃复性45 s，72℃延伸60 s，循环35次；72℃延伸10 min；最后于4℃保温。扩增产物在2%的非变性琼脂糖凝胶上进行电泳，检测目的条带。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取叶、茎、花蕾总RNA浓度和纯度比较

由表1可知，对于叶，Trizol法效果最佳；改良CTAB法则最适于提取茎的总RNA；对于花蕾，因其含有较多的糖、酚等次生代谢物，则多糖多酚试剂盒法效果最佳。以上方法提取的总RNAOD260/280为 1.8-2.0，OD260/230＞2.0， 显示得到的RNA质量较高。其浓度也符合后续试验要求。SDS法对三个部位的总 RNA提取效果均较差；观察其余RNA样品的OD值，表明也许存在异硫氰酸胍及β-巯基乙醇残留或者蛋白质及糖、酚污染。

表1 不同方法提取叶、茎、花蕾总RNA的浓度和纯度比较

2.2 总RNA电泳分析

由图1可以看出，SDS法提取的叶、茎、花蕾总RNA较差，28S，18S条带隐约可见，5S条带明亮，说明RNA降解程度大，且有DNA污染。Trizol法仅现叶的总RNA，其28S,18S条带清晰，28S的亮度为18S的1.5～2.0倍，5S条带隐约可见，未见DNA污染，说明此RNA完整性较好。改良CTAB法提取的茎总RNA，28S，18S条带清晰，5S条带很浅，说明RNA完整性好且未见DNA污染。多糖多酚试剂盒法提取的花蕾总RNA，28S，18S条带清晰适中，但有轻微DNA污染；电泳结果基本与表1相符。

图1 不同方法提取灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾中总RNA电泳图

2.3 RT-PCR检测

进一步验证上述方法提取得到的总RNA质量，根据灰毡毛忍冬高通量测序结果中AGL19 Unigene序列应用Primer 5.0设计引物进行RT-PCR，均可扩增得到约640 bp目的条带。由此说明以上提取的总RNA均能用于后续实验。

图2 灰毡毛忍冬叶、茎、花蕾总RNA RT-PCR反应产物电泳图

3 讨论

目前关于植物总RNA提取方法的报道已有很多[8-10]，但从不同植物或同一植物的不同品种或同种植物的不同组织器官中提取高质量RNA难度迥异，这主要与植物细胞积累的次生代谢产物密切相关，如酚类化合物、多糖、次级代谢产物以及降解RNA 的RNase等[11-13]。植物内源和外源RNA酶含量丰富，RNA比DNA容易降解，因此RNA的提取条件更为苛刻。在RNA提取的整个过程中，除避免引入杂质及细菌外，还应尽量去除细胞里的多糖、多酚、蛋白质及DNA等杂质及提取过程中所加入的试剂（β-巯基乙醇等）。

不同种类植物体内积累的次生代谢产物及化学成分各异，没有一种RNA的提取方法适合于所有植物。加之不同的RNA提取方法亦各有优缺点，故应对不同物种及不同组织特性的材料进行选择或改良适合的RNA提取方法[14-15]。本研究通过比较四种提取总RNA的方法发现，对于灰毡毛忍冬的叶、茎、花蕾，SDS法提取的总RNA质量差，而应用广泛的Trizol法和改良CTAB法分别对叶、茎能提取出质量较好的总RNA，有针对性地对本身富含多糖多酚的花蕾使用多糖多酚试剂盒则能提取出高质量总RNA。因此，在进行植物样品总RNA提取前，需先了解样品所含成分、性质，选择适合的提取方法，提取出高质量RNA，为灰毡毛忍冬相关基因的全长克隆及其时空表达模式分析提供物质基础。

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（本文编辑 杨 瑛）

Screening of Total RNA Extraction Methods For Full-length Gene Cloning from Different Organs in Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.

LIU Xiangdan,XU Yuqin,WANG Shan,TONG Qiaozhen,ZHOU Ribao*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo screen of total RNA extraction methods from different organs in Lonicera Macranthoides Hand.-Mazz (L.Macranthoides).MethodsThe total RNA of leaf,stem and flower buds from L.macranthoides,respectively,were isolated by SDS,Trizol,improved CTAB and polysaccharide polyphenols kit methods,and the results were compared.ResultsSDS was not suitable for this experiment;Trizol only could isolate total RNA from its leaf.Improved CTAB was the best way to isolate total RNA from its stem;Polysaccharide polyphenols kit method could isolate total RNA from its flower buds,and obtained specific bands by RT-PCR.ConclusionTrizol can be used to isolate the total RNA from leaf of L.macranthoides. Improved CTAB was the best method to isolate the total RNA from its stem;Polysaccharide polyphenols kit method could be used to isolate the total RNA from its flower buds.The total RNA by the three methods could meet the request of fulllength gene cloning and temporal and spatial expression analysis.

Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.;full-length gene cloning;total RNA;different organs;extraction method

R284.1

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.017

2015－08-12

国家自然科学基金（81203007）；湖南省自然科学基金（13JJ9010）；湖南省教育厅科技创新平台（14K071）；湖南省“中药学”重点学科建设项目资助（湘教通[2011]76号）；国家中医药管理局“药用植物学”重点学科资助（国中医药发[2009]30号）；中药学湖南省重点学科开放基金（zy201403）；湖南中医药大学青苗计划。

刘湘丹，女，博士，讲师，研究方向：中药资源与质量。

*周日宝，男，博士，教授，博士研究生导师，E-mail：zhouribao20032003@aliyun.com。