辛开苦降法对脾胃湿热证大鼠胃黏膜上皮细胞p53、Bcl-2 蛋白的影响*

郑春素，陈锦芳

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

王氏连朴饮具有清热利湿的功效，为辛开苦降法的代表方剂，本研究以复合因素诱导复制大鼠脾胃湿热证模型，通过胃肠病理取材确定胃黏膜病变程度，检测p53、Bcl-2 蛋白等指标，观察王氏连朴饮治疗后的变化情况，尝试从分子生物学角度观察脾胃湿热证的本质并揭示王氏连朴饮的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康SPF 级SD 大鼠60 只，雄性，体重（200±20）g。（购自福建中医药大学实验动物中心，合格证：SCXK（闽）20150002）。伤寒沙门氏菌浓度：109CFU/mL（购自广东省微生物研究所）。AvantiTM230 型超速冷冻离心机由美国BECKMAN 公司生产，即用型P53-抗体与Bc1-2-抗体由武汉博士德生物有限工程公司提供，酶标定量测定仪由德国Thermo 公司生产。奥美拉唑（北京康蒂尼药业有限公司生产，批号：040321）规格：20mg/片（购于福建省第二人民医院西药房）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脾胃湿热证模型的制作

造模前各组动物禁食12h，自由饮水。正常组大鼠以基础饲料喂养26 d，并生活在20～28°C、50%～70%相对湿度环境。其余5 组参照陈佩婵[1]等人的脾胃湿热证造模方法，给予高脂高糖饲料（普通饲料中混入12%猪油，8%蜂蜜加工而成）进行喂养，10 d后在温度（33±2）℃，相对湿度75%±5%的环境中生活，共7 d，然后以鼠伤寒沙门氏菌灌胃，剂量为10mL/kg，24 h 后再次灌胃，剂量为5mL/kg。

1.2.2 王氏连朴饮药物的制备

参照《霍乱论》原方中药物比例：芦根60g，制厚朴6g，香豉、焦山栀各9g，川连、石菖蒲、制半夏各3g。以上药物均由福建省第二人民医院中药房提供。上述药物浸泡20min，入水量以覆盖药面2cm为度，先武火后文火煎煮约20min，滤去药渣取澄清药液。煎煮2 次后混匀并浓缩，保存在4°C 冰箱。

1.2.3 分组与给药

大鼠分笼适应性喂养3 d 后，60 只SD 大鼠随机分成正常组，生理盐水组、奥美拉唑组、王氏连朴饮高、中、低剂量组6 组，每组10 只。正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，西药组给予奥美拉唑浓缩液（1g/kg）灌胃；王氏连朴饮高、中、低剂量组分别按照不同浓度王氏连朴饮浓缩液（根据《中药药理研究方法学》中实验动物（按大鼠200g 体质量计算）与人（70kg）的体表面积比转换公式，5 倍给药，王氏连朴饮高、中、低剂量组浓度为16.2g/kg，8.1g/kg，4.1g/kg。）10mL/kg 体质量灌胃。每日1 次，连续灌胃1 周。

1.2.4 标本采集

末次给药后，各组大鼠不禁水，禁食12h，然后腹腔注射10%水合氯醛，大鼠麻醉后，剪取胃窦、大肠、十二指肠组织适量，于4%多聚甲酸溶液中，固定24h 以上，脱水，浸蜡，包埋，3μm 切片，HE 染色。

1.2.5 Bcl-2、P53 蛋白指标检测

釆用免疫组化SABC 法检测大鼠胃黏膜Bcl-2、P53 蛋白的表达水平，染色具体操作参照试剂说明书。以PBS 代替一抗作阴性对照，以已知的阳性切片做阳性对照。结果判断：细胞胞核呈棕黄色为p53 核表达呈阳性，细胞胞膜和胞浆呈棕黄色为Bcl-2 表达呈阳性。

1.2.6 统计学处理

所有数据用SPSS13.0 软件处理。计数资料用百分数表示，采用秩和检验。

2 结果

2.1 胃、十二指肠、大肠黏膜组织形态变化

HE 染色后，正常对照组大鼠胃黏膜层结构完整，大肠、十二指肠柱状上皮结构完好，绒毛排列紧密。生理盐水组大鼠胃黏膜组织表现为水肿和充血等改变，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞可于黏膜下层和固有层中见到；大肠、十二指肠可见黏膜组织充血水肿，上皮脱落、坏死，炎细胞浸大量润。与生理盐水组相比，奥美拉唑组、王氏连朴饮高、中、低剂量组大鼠胃黏膜、十二指肠绒毛上皮结构均完好（见图1）。

2.2 各组大鼠Bcl-2，P53 蛋白的变化

生理盐水组Bcl-2、P53 蛋白表达较正常组明显增加，差异明显，具有统计学意义（P＜0.05），与生理盐水组相比，奥美拉唑组、王氏连朴饮（高、中、低）剂量组Bcl-2，P53 蛋白表达降低，但王氏连朴饮低剂量组与奥美拉唑组间无显著性差异（P>0.05），王氏连朴饮高剂量组优于中低剂量组及奥美拉唑组，组间有显著性差异（P＜0.05），见表1。

图1 胃、十二指肠的组织学观察（×200）

表1 各组大鼠Bcl-2、P53 蛋白的变化

3 讨论

脾胃湿热证在临床中极为常见，既可由从外感受湿热之邪所致，也可因脾胃虚弱或过食肥甘厚味、辛辣刺激之物，致使湿热内蕴中焦而成，病势缠绵，病程较长，难以速愈。无论从理论还是临床中，辛开苦降法对脾胃湿热证的治疗作用已经得到了共识。王氏连朴饮出自王孟英的《霍乱论》，全方寒温互用，为辛开苦降的代表方，治疗脾胃湿热证具有较好的效果。

现代研究证实胃黏膜结构的完整性主要是由胃黏膜上皮细胞增殖、凋亡的平衡维持[2-5]。胃黏膜上皮细胞过度凋亡参与了胃黏膜损伤的发生过程。细胞凋亡是一个受基因调控的细胞主动死亡过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。现代学者通过对胃肠道黏膜上皮细胞凋亡机制的深入研究，发现胃肠道上皮细胞丢失的主要途径为细胞凋亡；胃肠道上皮细胞凋亡与胃肠疾病的发生关系密切；细胞凋亡的调控主要有抑制细胞凋亡、促细胞凋亡、协助细胞凋亡三种基因[6-8]。脾胃湿热证与消化系统疾病关系最为密切[9-15]，本研究表明模型组Bcl-2，P53 蛋白表达明显增加，说明脾胃湿热证的病变过程中细胞凋亡起了一定的作用，奥美拉唑组及王氏连朴饮各剂量组治疗后均较治疗前Bcl-2，P53 蛋白表达下降，说明药物对脾胃湿热证的改善机制可能通过影响细胞凋亡途径发挥作用，王氏连朴饮高剂量组的Bcl-2，P53 蛋白表达与正常组无显著差异，与王氏连朴饮中、低剂量相比，有显著差异，说明王氏连朴饮对脾胃湿热证的作用更加突出，从分子生物学角度探讨辛开苦降法治疗脾胃湿热证的的作用机制有助于更好地研究治疗脾胃湿热证的药物。

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