白及须根醇提物诱导肺腺癌细胞A549 凋亡研究*

蒋瑞彬，黄晶晶，李浩宇，潘 平，蒋福升，钱朝东，丁志山

（浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

肺癌是我国最常见的癌症之一，其中非小细胞肺癌占原发癌的75%～80%[1]。细胞凋亡是细胞的程序性死亡，在正常组织及肿瘤组织都广泛存在，它对维持机体的稳定起到非常重要的作用[2]。近年来，随着的对凋亡机制的研究，发现凋亡与肿瘤细胞的发生及发展中存在密切的关系，诱导细胞的凋亡成为目前研究肿瘤的靶点之一，也成为评价肿瘤治疗效果的指标之一。白及学名Bletilla striata（Thunb.）Reichb.F.，为兰科多年生草本球根植物，以干燥的块茎入药，用于治疗咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂等症[3]。有文献报道，白及含有的薜苈果糖可抑制肿瘤细胞的增长[4]。研究还发现，白及黏液质对大鼠瓦克癌（W256）、小鼠子宫癌（U14）、小鼠艾氏腹水癌、肝癌和肉瘤180 均有抑制作用。这可为白及用于临床治疗肿瘤疾病提供新的理论依据[5]。但全世界对于白及的研究还是很少，特别是抗肿瘤相关的研究，其活性成分和相关的药理作用还有待于我们继续研究[6-7]。

随着中国对于中医药事业的重视，白及在临床的需求越来越多，用药量不断增加[8]。白及的野生资源越来越少，已被列为国家濒危珍稀保护植物名录[9]。白及的药用部位为块茎，而在实际的操作过程中，白及的须根被大量浪费，在土地干旱的地区，白及的须根与块茎的比例达到1∶3～1∶4[10]。研究发现，人参总皂苷在主根的含量为5.22%，但须根却达到11.52%[11-12]，而人参总皂苷是人参的有效成分之一。单从人参皂苷含量看，须根的药用价值比人参主根高。因此，本研究将观察白及块茎和白及须根醇提物对肺腺癌细胞A549 增殖凋亡及相关机制的影响，并比较它们对A549 细胞抑制增殖的作用能力，以探讨白及醇提物在诱导肺癌细胞凋亡的分子机制。

1 材料

1.1 药材

白及购自浙江中医药大学饮片厂，白及块茎及白及须根醇提物由本实验室制备。

1.2 试剂

RPMI 1640 培养基（美国GIBCOBRL 公司，批号：13112105）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号：130407）；Hoechst 33342 染料（Sigma P4170）、PI 染料（Sigma P2261）；青霉素钠盐（华北制药有限公司，批号：1104303）；链霉素（华北制药有限公司，批号：1107106）；胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司，Amresco 分装）；二甲基亚砜（DMSO）（天津市永大化学试剂有限公司，批号：20120323）。

1.3 仪器

万分之一精密电子天平（AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；二氧化碳细胞培养箱（Thermo Electron Corporation HEPA CLASS100）；倒置荧光显微镜（OLYMPUS IX71）；酶标仪（Labsystems Wellscan Mk3）；流式细胞仪（GAVUA INSYTE 5）；荧光定量PCR 仪（StepOnePlusTM，USA）。

1.4 细胞株

肺腺癌细胞A549 由浙江中医药大学生物技术研究所提供。

2 方法

2.1 增殖抑制实验

将经含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养的肺腺癌细胞A549 制成3×104mL-1细胞悬液，按每孔100μL 接种于96 孔板，于37℃含5% CO2培养箱中孵 育 24h， 吸 掉 原 培 养 液， 用 不 同 浓 度（10，20，30，40，50，60μg·mL-1），每孔100μL 的白及块茎醇提物和须根醇提物分别处理24、48h 后，结束前4h 加入1.9mg·mL-1的MTS 液20μL，继续培养4h，于酶标仪490nm 波长处测定吸光度（A）值，重复3 次。细胞抑制率=（1-A加药/A对照）×100%，取3个重复孔为平均值，计算白及块茎醇提物与须根醇提物作用24、48h 的细胞成活率，实验重复3 次。

2.2 Hoechst-PI 双染白及块茎醇提物与须根醇提物诱导肺腺癌细胞A549 凋亡的影响

将细胞以3×103/孔接入到96 孔细胞培养板中，待其生长24h 贴壁后， 更换含有浓度为30，40，50μg·mL-1；白及块茎醇提物与须根醇提物的RPMI 1640 培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养48h，PBS 洗2 遍，分别加入Hoechst 与PI 溶液常温避光孵育10min，在荧光显微镜下观察凋亡细胞。

2.3 FITC 标记的Annexin-V/PI 双染流式细胞术分析

取经药物处理的A549 细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，用PBS 洗涤细胞2 次（2 000r/min 离心5min） 收集2×105细胞，加入500μL 的Binding Buffer 悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC 混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀，之后室温避光反应10min，立即用流式细胞仪检测Annexin VFITC 阳性（早期凋亡）和Annexin V-FITC/PI 双染阳性（晚期凋亡）细胞百分率。

2.4 二维水平细胞迁移实验

将A549 制成2×104mL-1细胞悬浮液，按苗孔1mL 接到24 孔细胞培养板中，于37℃含5% CO2培养箱中孵育24h，待细胞在培养板上形成均匀的一层，用10μL 的移液器吸头在培养板的中轴线轻轻划上一横，用PBS 洗去细胞残骸。分别加入含有浓度为30，40，50μg·mL-1白及块茎醇提物与须根醇提物的培养液培养，在0，12，24，48h 用倒置显微镜观察细胞的迁移情况，利用目镜的刻度尺测灵划痕的宽度（S），每个孔分别测量5 个点（两端，中间，左1/4，右1/4），最后平均值。细胞迁移率的计算公式如下：

细胞迁移率=（S零时间点-S测量点）/S零时间点×100%

2.5 RT-PCR 法检测Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因的mRNA 表达量

细胞分别经过30，40，50μg·mL-1白及须根醇提物处理48h 后用胰酶消化离心后，采用Trizol 法提取细胞的总RNA，后采用M-MLV 逆转录酶进行逆转录，采用荧光定量PCR 扩增Bcl-2、Bax、ICAM-1，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参，引物参考文献[13]中的序列，引物由上海生工生物技术公司合成。Bcl-2 引物序列：上游引物为5’-TgTgTgTggAgAgCgTCAACC-3’，下游引物为5’-TTCAgAgACAgCCAggAgAAATC-3’；Bax 引物序列：上游引物为5’-TCAggATgCgTCCACCAAgAA-3’，下游引物为5’-TCCCggAggAAgTCCAATgTC-3’；ICAM-1引物序列：上游引物为5’-TAgCCAACCAATgTgCTATT-3’，下 游 引 物 为5’-CAgCgTAgggTAAggTTCTTg-3’；内参（GAPDH）序列为：上游引物为5’-ATT CAACggCACAgTCAAgg-3’，下游引物为5’-gCAgAAggggCggAgATgA-3’。在荧光定量PCR 仪中设置一下参数：94℃预变性1 min；94℃变性20 sec，55℃退火20 sec，72℃延伸20 sec，读板，共40 个循环；融解曲线。得到每个样品的Ct 值，以空白对照组为对照，以GAPDH 为内参基因，计算每个样品的目的基因的相对表达量2-△△Ct。

△△Ct =[待测组目的基因平均Ct 值-待测组内参基因平均Ct 值]-[对照组目的基因平均Ct 值-对照组内参基因平均Ct 值]。

2.6 结果统计

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析来比较各组间的差别有无显著性统计学差异。

图1 白及须根醇提物及块茎醇提物对A549 细胞增殖的影响

3 结果

3.1 白及块茎醇提物及须根醇提物对肺腺癌细胞株A549 的增值影响。

随着药物浓度的提高，白及块茎醇提物与须根醇提物都能明显降低细胞的存活率，有明显的剂量依赖关系。由图1 可以看出，在相同的作用时间和药物浓度的情况下，白及须根醇提物抑制A549 细胞的增值效果明显好于白及块茎醇提物。

图2 Hoechst-PI 双染白及须根醇提物诱导肺腺癌细胞A549 凋亡的影响

3.2 Hoechst-PI 双染白及须根醇提物诱导肺腺癌细胞A549 凋亡的影响

通过Hoechst-PI 双染结果可知，随着药物浓度的升高，细胞的形态发生了明显的变化。对照组细胞呈梭形或椭圆形，胞浆饱满，核区染色均匀，给药组随着浓度升高，凋亡细胞明显增多。在药浓度为40μg·mL-1时，细胞出现凋亡，细胞皱缩，核区体积变小，Hoechst 染色可见致密浓染荧光。在药浓度为50μg·mL-1时，细胞开始大量死亡，PI 染色后可见强红色荧光，见图2。

3.3 FITC 标记的Annexin-V/PI 双染流式细胞术

由图3 可知，白及须根醇提物诱导A549 细胞株Annexin-FITC 阳性（早期凋亡）和Annexin VFITC/PI 双染阳性（晚期凋亡）细胞百分率增高，呈现出浓度依赖性。

3.4 白及须根醇提物对A549 迁移的影响

由图4 可知，与对照组相比，当细胞给予30，40，50μg·mL-1的白及须根醇提物时，48h 时A549 细 胞 的 迁 移 率 分 别 为65.1% 、50.93% 、24.17%，说明在48h 内白及须根醇提物可以明显的抑制住A549 在二维水平上的移动。

3.5 白及须根醇提物对肺腺癌A549 细胞Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因mRNA 的影响

实验结果显示白及须根醇提物能够有效的降低ICAM-1 及bcl-2 基因mRNA 相对表达量，并且随着药物浓度的增加而降低，而促进细胞凋亡的基因bax 随着药物浓度的增加其表达量增加，呈现浓度依赖效应。这就说明白及须根醇提物能够通过抑制bcl-2 基因的表达，降低Bcl-2 与Bax的比率来诱导肺腺癌细胞的凋亡，也能通过抑制ICAM-1 基因的表达来抑制A549 肺腺癌细胞的转移和粘附见图5。

图3 Annexin-V/PI 双染细胞流式仪分析

图4 不同浓度白及须根醇提物对A549 细胞二维水平迁移的影响

4 讨论

白及作为我国的传统中药材，是治疗肺胃出血的要药，说明白及的作用靶点主要为肺与胃。本研究利用肺腺癌细胞，发现白及的须根醇提物对于抑制A549 细胞增殖的效果明显好于白及的块茎醇提物，本研究还发现白及须根醇提物能减少Bcl-2 基因的表达，降低Bcl-2 与Bax 的比率来诱导肺腺癌细胞的凋亡，同时通过减少ICAM-1 基因的表达来抑制肿瘤细胞的迁移。而在实际操作过程中，白及的须根作为边角料而被大量的丢弃，根据我们的研究结果，这为以后白及的综合利用开发奠定基础。

图5 不同浓度白及须根醇提物A549 细胞中ICAM-1、bcl-2、bax 表达的影响

细胞凋亡出现的一个重要症状是细胞的通透性增强，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受损而不能将Hoechst 33342 染料排出细胞外，因此Hoechst 33342 能够进入到凋亡细胞要比正常细胞要多，使荧光增强，而PI 染料不能进入具有完整细胞膜的正常细胞和凋亡细胞。通过Hoechst 与PI 的双染我们就很清楚的区分开正常细胞、凋亡细胞与死亡细胞。细胞的凋亡还受到很多基因的控制，Bcl-2 基因是研究最早于凋亡相关的基因，也是目前研究最热的关于调控细胞凋亡的基因，Bcl-2 主要是通过形成同源二聚体或异源二聚体来调控细胞的凋亡，当Bax 形成同源二聚体诱导细胞凋亡，Bax 就能与Bcl-2 形成异源二聚体来实现Bcl-2 抑制细胞凋亡的功能[14]。在线粒体上的Bcl-2 至少在以下两个水平来调节细胞的凋亡：①通过改变线粒体膜上的电位来调控细胞的凋亡。因为在细胞的凋亡过程中，线粒体的疏基会成为包内氧化还原电位的传感器，Bcl-2 就可以抑制谷胱甘肽的外泄来降低胞内的氧化还原电位，从而抑制细胞的凋亡。②Bcl-2 能够调节线粒体膜上对某些蛋白前体的通透性，Bax 能在较广泛的pH 范围内形成离子孔道，它能允许小分子或者是离子穿过线粒体膜进入细胞质，从而引起细胞的凋亡，而Bcl 的作用相反，它能关闭Bax 形成的通道，抑制细胞的凋亡，通过Bcl-2与Bax 的比率来调控细胞凋亡[15]。而ICAM-1 是一种细胞黏附因子，它在人体的正常细胞内一般很少表达或不表达，但在一些肿瘤细胞中ICAM-1 会过表达，所以它在肿瘤细胞的转移和黏附过程中起到很重要的作用[16]。

综上所述，白及块茎及其须根的醇提物都能促进肺腺癌细胞A549 的凋亡，且须根的效果要好于块茎，所以白及须根具有一定的开发利用价值，值得进一步研究。

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