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片仔癀通过PI3K/Akt 信号通路诱导人骨肉瘤U2OS 细胞凋亡*

2015-08-10林海英刘俊宁陈炳艺

云南中医学院学报 2015年5期
关键词:片仔癀批号诱导

林海英,刘俊宁,陈炳艺,李 楠,张 燕

(福建中医药大学骨伤学院,福建 福州350122)

骨肉瘤是一种好发于青少年的原发性骨源性恶性肿瘤[1]。肿瘤生长迅速,可早期发生肺转移,同时还存在对化疗药物的多药耐药,因此尽管近30年来化疗药物和手术方式已取得重大的进展,骨肉瘤5 年生存率并没有得到明显提高[2-3]。探寻有助于提高疗效的药物对骨肉瘤的治疗有着积极的临床意义。

传统中药片仔癀主要成分为三七、牛黄、麝香、蛇胆等,具有清热解毒,消痈散结的功效。前期体内外实验证实片仔癀能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,抑制骨肉瘤肺转移[4-6]。近年来发现磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (Phosphatedayliositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路在骨肉瘤细胞的增殖、分化、存活和迁移等方面发挥作用,是重要的凋亡抑制通路[7]。本实验通过检测片仔癀在诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡过程中,PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的表达变化,进一步探讨片仔癀诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡的可能机制,为临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,美国Gibco公司,批号:15121250);兔抗人Phospho-Akt(Thr473)单克隆抗体(美国CST 公司,批号:0019),兔抗人Akt 单克隆抗体(批号:0017);兔抗人PARP单克隆抗体(批号:0007)兔抗人Cleave PARP 单克隆抗体(批号:0006);PI3K 抗体试剂盒(批号:0000);β-actin 抗体(批号:0002)均购于美国CST公司;蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail(德国Merck Millipore 公司,批号:D00155412),磷酸酶抑制剂Phosstop(瑞士Roche 公司,批号:10995100);高灵敏度化学发光底物Super signal West Femto(美国Thermo 公司,批号:PH204945);Bio-Tex ELX 800 酶标仪(美国BioTek 公司);OlympusIX70 倒置荧光显微镜(日本Olympus 株式会社);GEL DOC 2000 凝胶成像系统(美国Bio-Rad 公司)。

1.2 药物配置

片仔癀(漳州片仔癀药业股份有限公司,规格:600mg/粒,批号:1101007),将片仔癀粉末溶于PBS溶液中,使终浓度为30mg/mL,高压灭菌,-20℃保存,使用前用培养基稀释。

1.3 细胞系和细胞培养

人骨肉瘤细胞株U2OS 由中国科学院上海生命科学研究院提供。人骨肉瘤U2OS 细胞置于37℃、5% CO2恒温培养箱,含有10%的FBS、100U/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素RPMI1640 培养基培养,待细胞生长密度达80%~90%,0.25%的胰酶消化传代,取对数生长期的细胞进行实验。

1.4 MTT 法检测细胞增殖

对数生长期U2OS 细胞,0.25%胰酶消化,按1×104/孔接种于96 孔板,贴壁24h 后,以不加药组为空白对照组,实验组加入不同浓度的片仔癀药液,每组设6 个复孔。分别于干预24,48,72h 后,去除含药培养基,每孔加入100μL 含MTT 的培养基(MTT 浓度为0.5 mg/mL),孵育4h 后弃MTT,每孔加入100μL DMSO,置于37℃5%CO2培养箱15min,震荡使结晶充分溶解,酶标仪490nm 波长处测定吸光度值。按照公式:抑制率=(1-药物组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%,计算每组的生长抑制率,实验重复3 次。

1.5 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态

对数生长期U2OS 细胞,以1×105/孔接种于12孔板,贴壁24h 后,加入不同浓度片仔癀溶液,并设空白对照组。干预48h 后,弃培养基,PBS 洗涤2次,每次3min,4%多聚甲醛室温固定15min 后,去除固定液,PBS 洗涤2 次,每次3min。加入终浓度为10μg/mL Hoechst 33258 避光染色30min,再次用PBS 洗涤2 次,每次3min,倒置荧光显微镜下观察细胞核形态的变化。

1.6 Western blot 法检测PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白的表达

不同浓度片仔癀溶液干预U2OS 细胞48h,预冷PBS 洗细胞3 遍,尽量吸净PBS 后加300μL 配置好的RIPA 裂解液[1mL 的RIPA 裂解液加10μL PMSF (100 ×)、10μL Protease inhibitor cocktail(100×)、100μL Phosstop(10×),现配现用],提取总蛋白,BCA 法来测定蛋白浓度。5×蛋白上样缓冲液将蛋白样品变性,-20℃保存。每孔20μg 蛋白上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白转到PVDF 膜上,室温封闭2 h,分别加入不同稀释比例的一抗,兔抗人β-actin(1 ∶1000)、PI3K p85α(1 ∶1000)、p-PI3K p85α(1 ∶1000)、Akt(1 ∶1000)、p-Akt(Thr473)(1 ∶2000)、PARP(1 ∶1000)、Cleave PARP(1 ∶1000),4 ℃侧摆摇床过夜;TBST 洗涤3 遍,每遍10min;加入二抗(1 ∶2000 稀释),室温孵育1.5h;TBST 洗涤3遍,每遍10min;用Super signal West Femto 最高灵敏度化学发光底物显色。Image Lab 3.0 软件分析软件进行灰度扫描,目标蛋白灰度值与β-actin 灰度值之比,作为目的蛋白表达水平的相对值。实验重复3 次。

1.7 统计学分析

实验数据以SPSS 13.0 统计软件进行分析,数据采用(x±s)表示,采用配对t 检验和双因素方差分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 片仔癀对U2OS 细胞增殖抑制作用

MTT 结果显示片仔癀作用时间相同时,细胞抑制率随着药物浓度的增加而增大;而相同浓度片仔癀干预细胞,随作用时间的延长,细胞抑制率逐渐增大,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),说明随着片仔癀浓度的不断增加,作用时间的不断延长,对U2OS 细胞的增殖抑制率不断升高(表1)。

表1 片仔癀对U2OS 细胞的抑制率(x±s,n=6)

2.2 片仔癀对U2OS 细胞凋亡的影响

不同浓度片仔癀干预U2OS 细胞48h 后,Hoechst 33258 染色后荧光显微下观察见对照组细胞核呈圆形均匀的蓝色荧光,片仔癀组表现为细胞核缩小,染色质浓缩等典型的细胞凋亡的表现,且随药物浓度的增大,凋亡细胞逐渐增多,细胞数目逐渐减少(图1)。

图1 Hoechst 33258 染色观察片仔癀干预U2OS 细胞48h 后凋亡形态

2.3 片仔癀对U2OS 细胞PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白表达的影响

蛋白质印迹方法检测PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的表达变化显示,不同浓度片仔癀干预骨肉瘤U2OS 细胞48h 后,p-PI3K p85α 表达逐渐减少,0.8和1.2mg/mL 组与空白对照组比较差异有统计学意义(0.8mg/mL 组P<0.05,1.2mg/mL P<0.01),而PI3K p85α 基本保持不变;p-Akt 的表达随药物浓度的增加而减少,0.8 和1.2mg/mL 组与空白对照组比较差异有统计学意义(0.8mg/mL 组P<0.05,1.2mg/mL 组P<0.01),Akt 的表达变化不明显;随着药物浓度的增加,PARP 的表达减少,尤其是1.2mg/mL 组,同时Cleaved PARP 表达量逐渐增多,与空白对照组比较差异有统计学意义(0.4,0.8mg/mL 组P<0.05,1.2mg/mL 组P<0.01)。提示片仔癀诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡与减少p-PI3K p85α、p-Akt 蛋白表达,上调Cleaved PARP 表达量,调控PI3K/Akt 信号途径有关(图2)。

3 讨论

骨肉瘤属于中医“石痈”、“石疽”、“石岩”等范畴,多发于青少年,局部表现为肿块生长迅速,持续性疼痛,皮温高,静脉怒张,全身则有低热、贫血、乏力等。局部肿胀、静脉怒张为瘀血之征,肿胀灼痛,刺痛拒按,皮温升高,难消难溃,伴有发热,属痰瘀互结,热毒内蕴,故临床以“化瘀散结、清热解毒”之法治疗[8]。片仔癀由蛇胆、牛黄、三七、麝香等中药组成,具有清热解毒,消痈散结的功效,片仔癀治疗恶性肿瘤具有明显疗效[9-10]。

图2 片仔癀对骨肉瘤U2OS 细胞PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的影响

PI3K/Akt 信号途径是近年来发现的细胞内重要信号转导通路之一,该信号途径的异常激活存在于多种人类肿瘤中,具有促进肿瘤细胞增殖和存活,抑制肿瘤细胞凋亡的作用[11-12]。研究证实骨肉瘤中存在着PI3KCA 基因突变,从而激活PI3K 通路,与骨肉瘤恶性程度相关[13];Fukaya 也发现骨肉瘤组织中存在着Akt 的过度表达和活化[14];王恒[15]研究发现通过抑制PI3K/Akt 信号通路,能够抑制骨肉瘤U2OS 的增殖、侵袭及迁移等肿瘤恶性特征,认为PI3K/Akt 通路在骨肉瘤细胞的恶性表型中起到十分重要的作用。Perry 等[16]检测了59 例骨肉瘤及正常组织的全外显子组、全基因测序,通过分析基因组对骨肉瘤生存率的影响,发现PI3K/Akt 通路是骨肉瘤治疗的一个关键点。

在PI3K 家族中,ⅠA 型PI3K 是由调控亚基p85 和催化亚基p110 组成的异二聚体,是目前研究最多,功能最广泛,被认为与肿瘤的发生关系最为密切的PI3K[17]。p85 调节亚基能够稳定p110 催化亚基,是ⅠA 型PI3K 激活所必须的。p85 调节亚基包括p85α、p85β、p85γ 三种,其中PI3Kp85α 是PI3K中含量最丰富的调节亚基。在生长因子和激素刺激下,PI3Kp85α 通过其SH2 区域在细胞质中与受体酪氨酸激酶磷酸化酪氨酸残基结合,释放出p110,活化的p110 催化磷脂酰肌醇4,5 二磷酸(PIP2)转变为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),而PIP3 作为细胞内的第二信使,是Akt 转位于胞膜并被活化所必需的,从而促使Akt 持续磷酸化。Akt 的活化可以激活下游靶蛋白如Bcl-2 家族、细胞凋亡抑制蛋白,抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员的活化,从而抑制细胞凋亡。

宫晨等[18]实验研究显示PI3K/Akt 通路抑制剂LY294002 可明显抑制人骨肉瘤MG63 类肿瘤干细胞的增殖,其作用可能通过抑制P13K 进而抑制Akt 的磷酸化有关。4-HNE 可以改变Bcl-2/Bax 的比例,激活caspase-3 诱导骨肉瘤MG63 细胞凋亡,这一作用与抑制Akt 的活性密切相关[19]。从川续断根中提取的ADAPW 可通过下调人骨肉瘤HOS 细胞PI3K 和Akt 磷酸化蛋白的表达,抑制PI3K/Akt信号通路,诱导其凋亡[20]。

前期研究表明片仔癀能够有效抑制骨肉瘤U2OS 细胞的增殖,降低线粒体跨膜电位,改变线粒体通透性,增加Casepse-9、Caspase-3 的活性,下调Bcl-2 的表达促进其凋亡[21]。本实验通过检测PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt 蛋白的表达,以观察片仔癀对PI3K/Akt 信号途径活性的影响。结果显示片仔癀可浓度依赖性抑制骨肉瘤U2OS 细胞p-PI3K p85α 的表达,从而抑制了PI3K/Akt 信号途径的激活,同时p-AKt 表达的下降进一步印证了这一点。抑制PI3K/Akt 信号途径,可诱导骨肉瘤细胞凋亡,我们在Hoechst 33258 染色观察片仔癀干预U2OS 细胞48h 后凋亡状况中可以看到随着药物浓度的增加,细胞凋亡增加。核多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP,参与环境胁迫应答中的DNA 修复,协助细胞维持生存能力,PARP 的裂解促进细胞崩解并可以作为细胞凋亡的标记物。通过检查测PARP、Cleaved-PARP 蛋白的表达,可以看到片仔癀可明显促进Cleaved-PARP 蛋白的表达。

综上所述,片仔癀可通过抑制PI3K p85α、Akt蛋白磷酸化,抑制PI3K/Akt 信号途径的激活,促进PARP 的裂解,诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

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