片仔癀通过PI3K/Akt 信号通路诱导人骨肉瘤U2OS 细胞凋亡*

林海英，刘俊宁，陈炳艺，李 楠，张 燕

（福建中医药大学骨伤学院，福建 福州350122）

骨肉瘤是一种好发于青少年的原发性骨源性恶性肿瘤[1]。肿瘤生长迅速，可早期发生肺转移，同时还存在对化疗药物的多药耐药，因此尽管近30年来化疗药物和手术方式已取得重大的进展，骨肉瘤5 年生存率并没有得到明显提高[2-3]。探寻有助于提高疗效的药物对骨肉瘤的治疗有着积极的临床意义。

传统中药片仔癀主要成分为三七、牛黄、麝香、蛇胆等，具有清热解毒，消痈散结的功效。前期体内外实验证实片仔癀能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，抑制骨肉瘤肺转移[4-6]。近年来发现磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （Phosphatedayliositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路在骨肉瘤细胞的增殖、分化、存活和迁移等方面发挥作用，是重要的凋亡抑制通路[7]。本实验通过检测片仔癀在诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡过程中，PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的表达变化，进一步探讨片仔癀诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡的可能机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司，批号：15121250）；兔抗人Phospho-Akt（Thr473）单克隆抗体（美国CST 公司，批号：0019），兔抗人Akt 单克隆抗体（批号：0017）；兔抗人PARP单克隆抗体（批号：0007）兔抗人Cleave PARP 单克隆抗体（批号：0006）；PI3K 抗体试剂盒（批号：0000）；β-actin 抗体（批号：0002）均购于美国CST公司；蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail（德国Merck Millipore 公司，批号：D00155412），磷酸酶抑制剂Phosstop（瑞士Roche 公司，批号：10995100）；高灵敏度化学发光底物Super signal West Femto（美国Thermo 公司，批号：PH204945）；Bio-Tex ELX 800 酶标仪（美国BioTek 公司）；OlympusIX70 倒置荧光显微镜（日本Olympus 株式会社）；GEL DOC 2000 凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 药物配置

片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司，规格：600mg/粒，批号：1101007），将片仔癀粉末溶于PBS溶液中，使终浓度为30mg/mL，高压灭菌，-20℃保存，使用前用培养基稀释。

1.3 细胞系和细胞培养

人骨肉瘤细胞株U2OS 由中国科学院上海生命科学研究院提供。人骨肉瘤U2OS 细胞置于37℃、5% CO2恒温培养箱，含有10%的FBS、100U/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素RPMI1640 培养基培养，待细胞生长密度达80%～90%，0.25%的胰酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4 MTT 法检测细胞增殖

对数生长期U2OS 细胞，0.25%胰酶消化，按1×104/孔接种于96 孔板，贴壁24h 后，以不加药组为空白对照组，实验组加入不同浓度的片仔癀药液，每组设6 个复孔。分别于干预24，48，72h 后，去除含药培养基，每孔加入100μL 含MTT 的培养基（MTT 浓度为0.5 mg/mL），孵育4h 后弃MTT，每孔加入100μL DMSO，置于37℃5%CO2培养箱15min，震荡使结晶充分溶解，酶标仪490nm 波长处测定吸光度值。按照公式：抑制率=（1-药物组平均吸光值/对照组平均吸光值）×100%，计算每组的生长抑制率，实验重复3 次。

1.5 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态

对数生长期U2OS 细胞，以1×105/孔接种于12孔板，贴壁24h 后，加入不同浓度片仔癀溶液，并设空白对照组。干预48h 后，弃培养基，PBS 洗涤2次，每次3min，4%多聚甲醛室温固定15min 后，去除固定液，PBS 洗涤2 次，每次3min。加入终浓度为10μg/mL Hoechst 33258 避光染色30min，再次用PBS 洗涤2 次，每次3min，倒置荧光显微镜下观察细胞核形态的变化。

1.6 Western blot 法检测PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白的表达

不同浓度片仔癀溶液干预U2OS 细胞48h，预冷PBS 洗细胞3 遍，尽量吸净PBS 后加300μL 配置好的RIPA 裂解液[1mL 的RIPA 裂解液加10μL PMSF （100 ×）、10μL Protease inhibitor cocktail（100×）、100μL Phosstop（10×），现配现用]，提取总蛋白，BCA 法来测定蛋白浓度。5×蛋白上样缓冲液将蛋白样品变性，-20℃保存。每孔20μg 蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转到PVDF 膜上，室温封闭2 h，分别加入不同稀释比例的一抗，兔抗人β-actin（1 ∶1000）、PI3K p85α（1 ∶1000）、p-PI3K p85α（1 ∶1000）、Akt（1 ∶1000）、p-Akt（Thr473）（1 ∶2000）、PARP（1 ∶1000）、Cleave PARP（1 ∶1000），4 ℃侧摆摇床过夜；TBST 洗涤3 遍，每遍10min；加入二抗（1 ∶2000 稀释），室温孵育1.5h；TBST 洗涤3遍，每遍10min；用Super signal West Femto 最高灵敏度化学发光底物显色。Image Lab 3.0 软件分析软件进行灰度扫描，目标蛋白灰度值与β-actin 灰度值之比，作为目的蛋白表达水平的相对值。实验重复3 次。

1.7 统计学分析

实验数据以SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据采用（x±s）表示，采用配对t 检验和双因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 片仔癀对U2OS 细胞增殖抑制作用

MTT 结果显示片仔癀作用时间相同时，细胞抑制率随着药物浓度的增加而增大；而相同浓度片仔癀干预细胞，随作用时间的延长，细胞抑制率逐渐增大，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明随着片仔癀浓度的不断增加，作用时间的不断延长，对U2OS 细胞的增殖抑制率不断升高（表1）。

表1 片仔癀对U2OS 细胞的抑制率（x±s，n=6）

2.2 片仔癀对U2OS 细胞凋亡的影响

不同浓度片仔癀干预U2OS 细胞48h 后，Hoechst 33258 染色后荧光显微下观察见对照组细胞核呈圆形均匀的蓝色荧光，片仔癀组表现为细胞核缩小，染色质浓缩等典型的细胞凋亡的表现，且随药物浓度的增大，凋亡细胞逐渐增多，细胞数目逐渐减少（图1）。

图1 Hoechst 33258 染色观察片仔癀干预U2OS 细胞48h 后凋亡形态

2.3 片仔癀对U2OS 细胞PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白表达的影响

蛋白质印迹方法检测PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的表达变化显示，不同浓度片仔癀干预骨肉瘤U2OS 细胞48h 后，p-PI3K p85α 表达逐渐减少，0.8和1.2mg/mL 组与空白对照组比较差异有统计学意义（0.8mg/mL 组P＜0.05，1.2mg/mL P＜0.01），而PI3K p85α 基本保持不变；p-Akt 的表达随药物浓度的增加而减少，0.8 和1.2mg/mL 组与空白对照组比较差异有统计学意义（0.8mg/mL 组P＜0.05，1.2mg/mL 组P＜0.01），Akt 的表达变化不明显；随着药物浓度的增加，PARP 的表达减少，尤其是1.2mg/mL 组，同时Cleaved PARP 表达量逐渐增多，与空白对照组比较差异有统计学意义（0.4，0.8mg/mL 组P＜0.05，1.2mg/mL 组P＜0.01）。提示片仔癀诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡与减少p-PI3K p85α、p-Akt 蛋白表达，上调Cleaved PARP 表达量，调控PI3K/Akt 信号途径有关（图2）。

3 讨论

骨肉瘤属于中医“石痈”、“石疽”、“石岩”等范畴，多发于青少年，局部表现为肿块生长迅速，持续性疼痛，皮温高，静脉怒张，全身则有低热、贫血、乏力等。局部肿胀、静脉怒张为瘀血之征，肿胀灼痛，刺痛拒按，皮温升高，难消难溃，伴有发热，属痰瘀互结，热毒内蕴，故临床以“化瘀散结、清热解毒”之法治疗[8]。片仔癀由蛇胆、牛黄、三七、麝香等中药组成，具有清热解毒，消痈散结的功效，片仔癀治疗恶性肿瘤具有明显疗效[9-10]。

图2 片仔癀对骨肉瘤U2OS 细胞PI3K/Akt 信号途径相关蛋白的影响

PI3K/Akt 信号途径是近年来发现的细胞内重要信号转导通路之一，该信号途径的异常激活存在于多种人类肿瘤中，具有促进肿瘤细胞增殖和存活，抑制肿瘤细胞凋亡的作用[11-12]。研究证实骨肉瘤中存在着PI3KCA 基因突变，从而激活PI3K 通路，与骨肉瘤恶性程度相关[13]；Fukaya 也发现骨肉瘤组织中存在着Akt 的过度表达和活化[14]；王恒[15]研究发现通过抑制PI3K/Akt 信号通路，能够抑制骨肉瘤U2OS 的增殖、侵袭及迁移等肿瘤恶性特征，认为PI3K/Akt 通路在骨肉瘤细胞的恶性表型中起到十分重要的作用。Perry 等[16]检测了59 例骨肉瘤及正常组织的全外显子组、全基因测序，通过分析基因组对骨肉瘤生存率的影响，发现PI3K/Akt 通路是骨肉瘤治疗的一个关键点。

在PI3K 家族中，ⅠA 型PI3K 是由调控亚基p85 和催化亚基p110 组成的异二聚体，是目前研究最多，功能最广泛，被认为与肿瘤的发生关系最为密切的PI3K[17]。p85 调节亚基能够稳定p110 催化亚基，是ⅠA 型PI3K 激活所必须的。p85 调节亚基包括p85α、p85β、p85γ 三种，其中PI3Kp85α 是PI3K中含量最丰富的调节亚基。在生长因子和激素刺激下，PI3Kp85α 通过其SH2 区域在细胞质中与受体酪氨酸激酶磷酸化酪氨酸残基结合，释放出p110，活化的p110 催化磷脂酰肌醇4，5 二磷酸（PIP2）转变为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP3 作为细胞内的第二信使，是Akt 转位于胞膜并被活化所必需的，从而促使Akt 持续磷酸化。Akt 的活化可以激活下游靶蛋白如Bcl-2 家族、细胞凋亡抑制蛋白，抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员的活化，从而抑制细胞凋亡。

宫晨等[18]实验研究显示PI3K/Akt 通路抑制剂LY294002 可明显抑制人骨肉瘤MG63 类肿瘤干细胞的增殖，其作用可能通过抑制P13K 进而抑制Akt 的磷酸化有关。4-HNE 可以改变Bcl-2/Bax 的比例，激活caspase-3 诱导骨肉瘤MG63 细胞凋亡，这一作用与抑制Akt 的活性密切相关[19]。从川续断根中提取的ADAPW 可通过下调人骨肉瘤HOS 细胞PI3K 和Akt 磷酸化蛋白的表达，抑制PI3K/Akt信号通路，诱导其凋亡[20]。

前期研究表明片仔癀能够有效抑制骨肉瘤U2OS 细胞的增殖，降低线粒体跨膜电位，改变线粒体通透性，增加Casepse-9、Caspase-3 的活性，下调Bcl-2 的表达促进其凋亡[21]。本实验通过检测PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt 蛋白的表达，以观察片仔癀对PI3K/Akt 信号途径活性的影响。结果显示片仔癀可浓度依赖性抑制骨肉瘤U2OS 细胞p-PI3K p85α 的表达，从而抑制了PI3K/Akt 信号途径的激活，同时p-AKt 表达的下降进一步印证了这一点。抑制PI3K/Akt 信号途径，可诱导骨肉瘤细胞凋亡，我们在Hoechst 33258 染色观察片仔癀干预U2OS 细胞48h 后凋亡状况中可以看到随着药物浓度的增加，细胞凋亡增加。核多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP，参与环境胁迫应答中的DNA 修复，协助细胞维持生存能力，PARP 的裂解促进细胞崩解并可以作为细胞凋亡的标记物。通过检查测PARP、Cleaved-PARP 蛋白的表达，可以看到片仔癀可明显促进Cleaved-PARP 蛋白的表达。

综上所述，片仔癀可通过抑制PI3K p85α、Akt蛋白磷酸化，抑制PI3K/Akt 信号途径的激活，促进PARP 的裂解，诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

[1] Robl B，Pauli C，Botter SM，et al. Prognostic value of tumor suppressors in osteosarcoma before and after neoadjuvant chemotherapy[J]. BMC Cancer，2015，15：379.

[2] Allison DC，Carney SC，Ahlmann ER，et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era[J].Sarcoma，2012：704872.

[3] Mirabello L，Troisi RJ，Savage SA. Osteosarcoma incidence an d survival rates from 1973 to 2004：data from the Surveillance，Epidemiology and end results program [J].Cancer，2009，115（7）：1531-1543.

[4] 张俐，于波，林建华. 中药片仔癀胶囊对骨肉瘤细胞诱导凋亡的作用[J]. 中国骨伤，2009，22（4）：265-268.

[5] 张燕，王琪鸿，张俐，等. 片仔癀对人骨肉瘤细胞U2OS 细胞周期的影响[J]. 江西中医学院学报，2012，24（5）：61-63.

[6] 杨德建. 片仔癀对裸鼠原位移植骨肉瘤的作用及机制研究[D]. 福州：福建中医药大学，2013.

[7] Niu NK，Wang ZL，Pan ST，et al. Pro-apoptotic and pro-autophagic effects of the Aurora kinase A inhibitor alisertib（MLN8237）on human osteosarcoma U-2 OS and MG-63 cells through the activation of mitochondria-mediated pathway and inhibition of p38 MAPK/PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Drug Des Devel Ther，2015，9：1555-1584.

[8] 王辉，孙桂芝. 孙桂芝治疗骨肉瘤经验[J]. 世界中医药，2012，7（1）：21-22.

[9] 孟丽萍，顾雪峰. 片仔癀联合治疗毒热瘀结型原发性肝癌免疫指标变化的临床观察[J]. 九江医学，2008，23（1）：31-37.

[10] 黄震，訾英，陆红. XELOX 化疗方案联合片仔癀治疗毒热瘀结型晚期结肠癌疗效观察[J]. 福建中医药，2014，45（5）：30-31

[11] Martini M，De Santis MC，Braccini L，et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer：an updated review [J]. Ann Med，2014，46（6）：372-383.

[12] Kuijjer ML，van den Akker BE，Hilhorst R，et al. Kinome and mRNA expression profiling of high-grade osteosarcoma cell lines implies Akt signaling as possible target for therapy[J]. BMC Med Genomics，2014，7：4.

[13] Choy E，Hornicek F，MacConaill L，et al. High-throughput genotyping in osteosarcoma identifies multiple mutations in phosphoinositide-3-kinase and other oncogenes [J]. Cancer，2012，118（11）：2905-2914.

[14] Fukaya Y，Ishiguro N，Senga T，et al. A role for PI3K-Akt signaling in pulmonary metastatic nodule formation of the osteosarcoma cell line，LM8 [J]. Oncol Rep，2005，14（4）：847-852.

[15] 王恒. FASN 和PI3K/Akt 反馈调节信号通路在骨肉瘤细胞U2OS 恶性表型中的研究[D]，南昌：南昌大学，2014.

[16] Perry JA，Kiezun A，Tonzi P，et al. Complementary genomic approaches highlight the PI3K/mTOR pathway as a common vulnerability in osteosarcoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（51）：E5564-5573.

[17] Mellor P，Furber LA，Nyarko JN，et al. Multiple roles for the p85α isoform in the regulation and function of PI3K signaling and receptor trafficking[J]. Biochem J，2012，441（1）：23-27.

[18] 宫晨. LY294002 对人骨肉瘤类肿瘤干细胞的影响及其作用机制[D]. 武汉：华中科技大学，2013.

[19] Ji GR，Yu NC，Xue X，et al. 4-Hydroxy-2-nonenal Induces Apoptosis by Inhibiting AKT Signaling in Human Osteosarcoma Cells[J]. The Scientific World Journal，2014：873525.

[20] Chen J，Yao D，Yuan H，et al. Dipsacus asperoides polysaccharide induces apoptosis in osteosarcoma cells by modulating the PI3K/Akt pathway[J]. Carbohydr Polym，2013，95（2）：780-784.

[21] 张燕，王琪鸿，牛素生，等. 片仔癀诱导U2OS 细胞凋亡与线粒体膜电位的关系[J]. 中华中医药杂志，2014，29（8）：2571-2574.