清热解毒化浊片对肠源性内毒素血症大鼠肝肺促炎因子IL-8及抗炎因子IL-10 的影响*

毛娅男，赵国荣，连俊凯，陈研焰，李雄安，何宜荣，艾碧琛

（湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙410208）

正常情况下，机体肠道内存在由大量G-细菌释放的内毒素（LPS），由于肠道粘膜的屏障作用，肝巨噬细胞（KC）的清除作用，LPS 很难进入体循环，当肠粘膜完整性破坏，KC 吞噬能力障碍时，大量LPS 入血，形成内毒素血症，引发全身炎症反应，因LPS 来自于肠道，故称为肠源性内毒素血症（IETM）。IETM 形成后可激活KC 大量释放炎性因子，造成肝、肺炎性损伤[1]，IETM 是急性肝衰竭、急性肺损伤、肝肺综合征、全身炎症反应综合征发生的重要原因。临床对于IETM 的治疗重点在于改善并发症，控制病情，尚无针对IETM 疗效确切的药物。清热解毒化浊片为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，具有减轻炎症反应，保肝护肝作用[2]。前期研究表明清热解毒化浊片可降低血浆内毒素水平，终止肝损伤的恶性循环，达到减轻肝脏炎性反应的目的[3]。本研究拟建立IETM 肝肺损伤大鼠模型，进一步探讨清热解毒化浊片对肝肺的保护作用。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性SD 大鼠70 只，体质量为（200±10）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（湘）2013-0005，合格证号：43004700007002。

1.2 药物与饲料

清热解毒化浊片由湖南中医药大学第一附属医院提供（批号：20140605），52°红星二锅头由北京红星股份有限公司提供（批号：20140128），大鼠普通饲料及高脂高糖饲料由湖南斯莱克景达实验动物公司提供。高脂高糖饲料综合文献[4]配制方法上进行改进，其组成为：77.3%基础饲料+0.2%丙基硫氧嘧啶+2%胆固醇+10%猪油+0.5%胆盐+8%蛋黄粉+2%白糖。

1.3 试剂与仪器

鲎试剂盒由湖南中医药大学第一附属医院肝病检测室提供，生化检测试剂盒由湖南中医药大学生化检测中心提供，IL-8、IL-10 兔抗鼠抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供，通用型PV-9000试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。罗氏全自动生化分析仪（罗氏公司生产），RT-6000 酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），Motic B5显微成像系统（麦克奥迪实业集团公司），电热恒温箱（上海精宏实验设备有限公司），电热恒温干燥烤箱（北京中兴伟业仪器有限公司），石蜡切片机、摊片机（天津市久圣医疗电子仪器有限公司）。

2 方法

2.1 动物模型制备

综合文献[5-6]方法并加以改进，予高脂高糖饲料喂养大鼠，同时每天按10mL/kg 剂量予52°二锅头灌胃1 次，并每周称大鼠体质量，根据体质量调整白酒剂量。以血液生化指标及肝、肺组织病理切片判断造模成功与否。

2.2 分组及给药

取SD 大鼠70 只，随机分为空白组（10 只）和造模组（60 只）。造模组大鼠按2.1 方法进行造模。模型成功后，将造模组大鼠随机分为模型组（10只）、清热解毒化浊片组（10 只），清热解毒化浊片组按0.081g/mL 灌胃，模型组及正常组予等容积蒸馏水灌胃，每组动物灌胃量均为1mL/100g·d-1，连续给药4 周。

2.3 取材及指标检测

末次给药结束后，禁食不禁水12h，次日清晨，腹主动脉采血，3 000r/min，离心10min，取血清，采用罗氏分析仪分别检测血清ALT、AST、GGT、ALP的含量，动态浊度法检测血浆LPS 含量。同时，迅速摘取肝、肺脏，在肝、肺脏最大叶，距边缘5mm 处取小块肝、肺组织，部分用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肝、肺组织病理学改变，部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，利用免疫组化PV 二步法检测肝、肺组织中IL-8、IL-10 含量，采用光学显微镜和全自动图像获取系统Olympus DP71 在高倍镜视野（×400）下随机选取5 个区域，测量并记录每个视野阳性染色的平均灰度值，作为该片的代表值，再计算该组的平均灰度，进行统计学比较。

2.4 统计学分析

采用SPSS17.0 统计软件处理。计量资料数据按均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肝、肺组织病理学改变

正常组大鼠肝小叶轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列。模型组可见肝小叶结构破坏，呈点、片状坏死，肝细胞水肿明显，胞质中可见大小不等、数量不一的圆形脂肪空泡，小叶中央静脉周围和汇管区有炎性细胞浸润。清热解毒化浊片组肝细胞轻微肿胀，结构较疏松，部分肝细胞内线粒体疏松，结构欠清晰。结果见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学形态观察（HE 染色×400）

正常组大鼠肺泡隔间距小，肺泡形态完整未见明显炎细胞浸润。模型组肺泡隔间距明显增宽，肺泡形态挤压，明显炎细胞浸润，有间质水肿可能。清热解毒化浊片组肺泡隔间距较正常组的增宽，肺泡形态完整可见少量炎细胞浸润。结果见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理学形态观察（HE 染色×400）

3.2 清热解毒化浊片对大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP，血浆LPS 的影响

与正常组比较，模型组具有显著性差异（P＜0.01，P＜0.05），提示造模成功。经治疗后，与模型组比较，清热解毒化浊片组血清ALT、AST、GGT、ALP均明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。结果见下页表1。

3.3 清热解毒化浊片对大鼠肝、肺组织IL-8、IL-10的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝、肺组织IL-8 表达存在显著性差异（P＜0.01）。经治疗后，与模型组比较，清热解毒化浊片组肝、肺组织IL-8 表达明显降低（P＜0.01），IL-10 表达升高（P＜0.05）。结果见下页表2、图3-4、图5-6。

表1 各组大鼠ALT、AST、GGT、ALP、LPS 的比较（x±s，n=10）

表2 各组大鼠肝、肺组织IL-8、IL-10 表达的比较（x±s，n=10）

图3 各组大鼠肝组织IL-8 阳性表达观察（免疫组化×400）

图4 各组大鼠肺组织IL-8 阳性表达观察（免疫组化×400）

4 讨论

中医尚无相应病名的论述与记载，据研究G-细菌所引起的疾病类似湿热病证的特点，而湿热病患者血浆内毒水平升高[7]，可见IETM 的中医病因病机与湿热浊毒有关。过食肥甘、嗜酒贪杯，致脾失健运，湿浊内生，湿久酿热，热久蕴毒，湿热浊毒胶着，热蒸湿动，弥漫脏腑经络，出现各脏腑的湿热症状。因此，中医治疗IETM 重点在于清热解毒，祛湿化浊。清热解毒化浊片由茵陈、滑石、木通、豆蔻仁、藿香、泽泻、黄芩、薄荷、连翘等组成，其中茵陈、木通、泽泻、滑石利湿化浊，导湿热从小便而出；藿香、豆蔻芳香化湿，导湿从表而解；黄芩、连翘、薄荷清热解毒，透热外达。全方分消上下，透达内外，共奏清热解毒、利湿化浊之效。临床发现，清热解毒化浊片对于湿热内蕴证患者有良好的治疗作用[8]。本实验通过高脂高糖、酒精等复合因素建立IETM 肝、肺损伤大鼠模型，经清热解毒化浊片治疗后，肝、肺损伤减轻，提示IETM 的形成与中医湿热浊毒密切相关。

图5 各组大鼠肝组织IL-10 阳性表达观察（免疫组化×400）

图6 各组大鼠肺组织IL-10 阳性表达观察（免疫组化×400）

多项研究认为IETM 是肝、肺损伤，肝肺综合征形成的病理基础。IETM 引发肝脏“二次打击”，从而激活KC 释放炎性介质如TNF-α、IL-1、IL-8 等，一方面炎性因子随血流入肺脏，导致肺脏炎性损伤；另一方面由于肝的解毒能力下降，被激活的肺内巨噬细胞代偿性清除LPS，同时分泌大量活性物质如NO、CO、TNF-α、IL-1、IL-8 及其他的炎性介质，加重肺脏损伤[9-10]。据文献报道，降低LPS 水平，可直接拮抗IETM 效应，达到减轻肝、肺炎性损伤的目的[11]，而前期研究发现清热解毒化浊片有降低患者血浆内毒素水平的作用。本研究通过复合因素建立IETM致肝、肺损伤大鼠模型，血浆LPS 水平升高（P＜0.05），血清ALT、AST、GGT、ALP 明显升高（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺组织出现炎性浸润、结构破坏等病理学改变，提示造模成功。经清热解毒化浊片治疗后血浆LPS 明显降低（P＜0.01），血清ALT、AST、GGT、ALP 均明显降低（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺组织炎性细胞浸润减轻，结构较前清晰，与文献报道一致，提示清热解毒化浊片可减轻因IETM 所致的肝、肺炎性损伤，其作用机制与降低血中LPS 水平有关。

IL-8 是一种促炎症因子，能特异性地促进中性粒细胞的趋化、变形、脱颗粒、释放溶酶体酶等参与炎症反应，与多种炎性疾病的发生发展密切相关[12]。当IETM 形成后LPS 即与KC 中TLR-4 受体结合导致TLR-4 寡聚化而被激活，通过MyD88 依赖和非MyD88 依赖的两条途径触发一系列的信号级联反应，诱导NF-KB、AP-1 和IRF-3 等转录因子磷酸化和核转位，上调IL-8 的表达，大量IL-8 释放入血，参与全身炎症反应[13]。研究认为，降低IL-8 的表达可减轻肝、肺组织的炎性损伤[14-15]。本实验，IETM致肝、肺损伤大鼠模型中，肝、肺组织炎性浸润，IL-8 表达水平明显升高（P＜0.01），经清热解毒化浊片治疗后肝、肺组织IL-8 明显降低（P＜0.01），炎性损伤减轻，与文献报道一致，提示清热解毒化浊片具有降低IL-8 水平，从而改善组织炎性损伤的作用。IL-10 是重要的抗炎因子，既能下调T 淋巴细胞活性，抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附，又可通过介导IKK-b/NF-κB 通路在转录水平上抑制炎性因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等表达，改善炎症反应[16]。本实验清热解毒化浊片组大鼠肝、肺组织均出现IL-10 表达较其他组明显升高（P＜0.01），提示清热解毒化浊片可升高IL-10 的水平，达到抗炎作用。

综上所述，清热解毒化浊片具有清热解毒、利湿化浊的功效，可治疗因IETM 所致的浊毒蕴结，其作用机制与降低血浆LPS 水平，促进抑炎因子IL-10 的表达，降低促炎因子IL-8 的释放，减轻肝、肺组织炎性损伤有关。

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