苓桂术甘汤含药血清对TGF-β1 诱导的大鼠心肌细胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的影响*

许 闪，黄金玲，2，王 靓，2△，施 慧，卲 菁，2，洪星辉，甘贤兵，2，刘 蕾

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥230038；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥230038）

慢性心力衰竭（CHF）是一种复杂的临床症状，是各种心脏病的严重阶段。目前研究证实，心室重构、内分泌及细胞因子的紊乱是CHF 病理生理过程发生发展的两大因素[1]。在初始的心肌损伤以后，多种内源性的神经内分泌和细胞因子系统的激活，进一步加重了心肌损伤和心功能恶化[2]。机体可产生多种细胞因子，心肌细胞也成为多种细胞因子作用的靶细胞。炎性细胞因子在慢性心力衰竭中发挥着重要的作用[3-4]。

课题组前期研究证明，体内实验中LGZGD 可以降低急性心肌梗死心室重构模型大鼠血清中TNF-α、IL-6 和ET-1 的含量，通过调节细胞因子网络干预急性心肌梗死后的心室重构[5]；体外实验中LGZGD 含药血清可以通过增加细胞存活率来保护由TGF-β1诱导的H9c2 细胞损伤，通过改善细胞凋亡形态、降低细胞凋亡率、降低心肌细胞H9c2 中胱天蛋白酶3 和胱天蛋白酶8 的含量来抑制TGF-β1诱导的大鼠心肌细胞H9c2 的凋亡。实验在前期研究基础上，体外培养大鼠心肌细胞H9c2 并通过TGF-β1的诱导来建立心肌细胞H9c2 损伤模型，通过ELISA 法测定TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的变化来观察LGZGD 含药血清对TGF-β1诱导的心肌细胞H9c2 损伤的影响，为CHF 的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞株

清洁级SD 大鼠，雄性（♂），体质量（200 ± 20）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（皖）2011-002；自由摄食和饮水，室温控制在20 ～25 ℃，相对湿度40%～60%，定时通风换气。大鼠心肌细胞株H9c2 购于中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。

1.2 药品与试剂

LGZGD 按原方比例（茯苓∶桂枝∶白术∶甘草=4∶3∶3∶2）参考文献[6]方法，由安徽省亳州市兴和药业有限公司提取制成含4.8 g 生药/g 的干浸膏粉末（批号：20141223），其中桂皮醛含量9.945 mg·g-1，甘草酸含量：14.71 mg·g-1，密封4 ℃冰箱保存备用。

高糖DMEM 培养基（美国Gibco 公司），胎牛血清（美国Gibco 公司），胰蛋白酶（美国Sigma 公司），人重组TGF-β1（批号0913209，美国PEPROTECH公司），TNF-α/IL-6/IL-1β 酶联免疫分析试剂盒（批号20150709，上海谷研实业有限公司）。

1.3 仪器

3111 型－恒温CO2培养箱（美国Thermo 公司），ATOM 全自动酶联免疫工作站（意大利MAROCHE），3K15-高速冷冻离心机（德国Sigma 公司），SW－CJ系列洁净工作台（AIRTECH，苏州安泰空气技术有限公司）。

1.4 含药血清的制备

取清洁级雄性SD 大鼠50 只，随机均分为空白对照组，按含生药量分别为LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1（分别相当于临床成人等效量的0.5，1，2 倍）等4 组，灌胃给药，10 mL·kg-1，空白对照组给予等体积的蒸馏水，连续给药5d，末次给药后1 h 各组大鼠无菌条件下腹主动脉取血，3 000 × g，离心15 min 后取血清，56 ℃水浴30 min 灭活补体，同组血清混匀，0.22 μm 滤膜过滤除菌，－80 ℃保存备用。

1.5 检测指标和方法

将对数生长期心肌细胞H9c2 以3×105个·mL-1的密度接种于6 孔板中，分成6 组，正常组、模型组、空白血清组、LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1含药血清组。空白血清组细胞以含10% 正常组大鼠血清的培养液培养，LGZGD 含药血清组细胞分别用含10% LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1的含药血清的培养液培养，12 h 后除正常组之外其余各组加入20 ng·mL-1TGF-β1，培养12 h 后收集细胞上清液，3000×g离心10min，取上清液按ELISA 试剂盒说明书分别检测TNF-α/IL-6/IL-1β 的含量。

1.6 统计学处理

使用SPSS17.0 for windows 统计软件进行生物学分析，结果用平均数±标准差表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著有统计学意义。

2 结果

LGZGD 含药血清对TGF-β1诱导H9c2 心肌细胞内TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影响，结果见表1。

ELISA 结果显示（表1），与正常组比，20 ng·mL-1TGF-β1作用心肌细胞H9c2 12 h 后，细胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的含量明显升高（P＜0.01），经过LGZGD 4.2，8.4 g·kg-1预处理组的H9c2 细胞TNF-α 和IL-6 的含量显著下降（P＜0.05、P＜0.01），经过LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1预处理组的H9c2细胞IL-1β 的含量也明显下降（P＜0.05、P＜0.01），以上结果说明LGZGD 含药血清可以降低由TGF-β1诱导的心肌细胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的升高，对心肌细胞H9c2 的损伤有一定的保护作用。

表1 LGZGD 含药血清对TGF-β1 诱导H9c2心肌细胞内TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影响

3 讨论

近年来研究发现，IL-1β、IL-6 和TNF-α 均可介导炎症反应，并且与心衰的严重程度正相关[7-9]。TNF-α 是由活化的单核巨噬细胞分泌的一种细胞激动剂，可损害血管内皮，抑制心肌收缩力[10]，诱导心肌细胞凋亡或坏死，导致左心室明显扩大，刺激成纤维细胞增殖，参与心室重构的病理过程[11-13]。IL-1β 可由多种细胞合成，主要来源于单核细胞，血管的平滑肌细胞和内皮细胞也可产生。研究证实，在CHF 中，IL-1β 可以抑制心肌蛋白质合成、促进其分解，降低心肌细胞收缩力；IL-1β 的增加还可促使其他具有负性肌力作用的细胞因子释放增加，如：TNF-α，并与TNF-α 协同发挥负性肌力和细胞毒效应并导致心肌功能的抑制[14]。IL-6 是参与心功能异常调节的细胞因子，对心肌细胞产生细胞毒性作用，直接损伤心肌细胞，促进心肌细胞肥大和加重心室重构[15]，抑制心肌细胞的兴奋收缩偶联。与此同时，TNF-α 既可诱导合成IL-1β，又可进一步激活IL-6[16]，IL-1β 也可诱导TNF-α 的分泌，并与TNF-α 协同诱导多种细胞产生IL-6，这3 种细胞因子相互作用，共同促进心室重构及CHF 的发生发展。

研究结果表明，TGF-β1作用于心肌细胞H9c2后，IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量显著升高，提示TGF-β1可以诱导心肌细胞H9c2 发生损伤，而经过LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1预处理组的H9c2 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明显下降（P＜0.05、P＜0.01），表明LGZGD 含药血清对TGF-β1诱导的H9c2 细胞损伤有显著的保护作用，其机制与抑制细胞因子过度激活有关。

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