蛹虫草菌种提纯复壮及其规律

左雪枝

摘要：以蛹虫草（Cordycps militaris）子实体为母本，采用组织分离法和子囊单孢子配对法制备子代母种，以母种菌丝形态、平板培养菌丝生长速度、见光培养菌丝转色性能、实际栽培出草结果等为菌种性能主要考察指标，探索优质菌种提纯复壮规律及方法。结果表明，菌种菌丝浓密、健壮、匍匐状，生长快、转色好，则出草形态好、产量高；组织分离法制备母种试管斜面菌丝形态优良率、平板生长及转色优良率、栽培出草优良率可达约95%、90%和85%，分别比子囊单孢子配对法高约10%、25%和40%，后者可产生约20%的更优菌株。说明组织分离法更适合遗传和保持母本性状，子囊单孢子配对法更适合筛选更优菌株，两种方法均可作为蛹虫草优良菌株提纯复壮的方法。

关键词：蛹虫草（Cordycps militaris）；组织分离法；单孢子配对培养法；产量

中图分类号：S567.3+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）13-3177-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.028

Purification-Rejuvenation and Its Law of Cordyceps militaris

ZUO Xue-zhi

（College of Bioengineering， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， Hubei， China）

Abstract：The mother plate culture mycelial morphology， mycelial growth rate， light color， the actual performance of mycelia grown grass results of strain performance of Cordyceps militaris were investigated by the quality of C. militaris as female parent， tissue isolation method and spore culture method paired preparation of sub mother. And the relevant quality spawn rejuvenation rules and method were explored. Results showed that the percentages of fine colonies in tube culture，plate culture， and the percentage of good growth， of spawn prepared by tissue isolation could attain 95%，90%，and 85% respectively， which were separately 10%，25% and 40% higher than those spawn prepared by monospore pairing cultivation， although the latter could produce 20% even better colonies. It was suggested that tissue isolation method was more suitable for the conservation of genetic and maternal character， while spore culture method was a more appropriate choice for screening better strains，although both methods could be used for the rejuvenation of the fine strain of C. militaris.

Key words： Cordyceps militaris； tissue isoloation； spore cultivation； yield

蛹虫草（Cordycps militaris）又名北冬虫夏草、北虫草，为虫草菌科（Cordycipitaceae）虫草属（Cordyceps Link）模式种[1]，20世纪末中国在世界上率先实现其人工栽培，目前规模化人工栽培及其深加工产业已初步形成[2，3]。然而，由于蛹虫草菌种极容易退化，已成为其产业化发展的主要瓶颈[3，4]。如何选育和延续优良菌种性能，确立优良母种制备及提纯复壮方法，对普及和发展蛹虫草人工栽培具有重要意义。菌种选育实践证明，从具有优良性状的真菌子实体中，以组织分离法及经减数分裂所形成的单孢子配对是选育优良菌种的基本和有效的方法。为此，从一般蛹虫草种植者急需对优良子实体进行良种选育及保持母本优良性状的实际出发，比较和探讨了子实体组织分离法和子囊单孢子配对法在蛹虫草良种选育及菌株复壮过程中的规律、特点及相关技术参数，以供相关人员借鉴。

1 材料与方法

1.1 菌种

优质蛹虫草原始母种D1由荆楚理工学院食用菌实验室分离、保藏和提供，供试子实体为该母种瓶栽后代。

1.2 培养基

母种分离培养基（改良PDA培养基）：200 g马铃薯（去皮），20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 g磷酸二氢钾，0.8 g硫酸镁，15 g琼脂，去离子水定容至1 000 mL，pH自然（实测值约6.5）；

栽培岀草培养基：30 g大米，45 mL营养液。其中营养液配方：30 g蚕蛹粉，1 g磷酸二氢钾，0.8 g硫酸镁，10 mg 维生素B1，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.5；

液体菌种培养基：30 g可溶性淀粉，10 g葡萄糖，10 g蛋白胨，2 g磷酸二氢钾，2 g硫酸镁，10 mg 维生素B1，去离子水定容至1 000 mL，pH 6.5；

菌丝生长及性能检测培养基（平板培养基）：200 g马铃薯（去皮），20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，15 g琼脂，1 g磷酸二氢钾，0.8 g硫酸镁，10 mg 维生素B1，去离子水定容至1 000 mL，pH自然；

1.3 方法

1.3.1 子代母种的制备 选取子实体数目较多、普遍粗且长、颜色典型、生长健壮的蛹虫草数瓶，从中选择较优子实体作为组织分离及子囊单孢子分离材料。组织分离法：以无菌去离子水清洗子实体3～4次，无菌条件下切取中上部2～3 cm小段，刮去橘红色外皮，切成1～2 mm小块，接入改良PDA试管斜面，适宜温度避光培养[5]（Y1）。单子囊孢子配对法：选取约七分熟子座，无菌去离子水冲洗，无菌滤纸吸干后悬挂于改良PDA锥形瓶平板上部，20 ℃恒温避光培养；当子囊单孢子弹射并在培养基平面形成数个早期小单孢菌落时[6]，随机选取2个单孢菌落转移至新的试管斜面并相互靠近，20 ℃避光培养（Y2）。各试管菌丝长满斜面即为子代母种。观察各组母种及各菌株菌丝色泽、形态、生长趋势等情况，与优质母种相比较，初步判断母种性能及差异。

1.3.2 母种转接至平板培养基 将制备的各子代母种取1 mm大小菌块，分别接种至菌丝生长及性能检测培养基，先避光培养5 d后再光照培养5 d，观察各组及各菌株菌丝形态、生长速度、转色程度等情况[7]；

1.3.3 母种转扩为液体菌种 另取制备的各子代母种5 mm大小菌块，接入150 mL液体培养基中，摇床150 r/min培养5～7 d至液体菌种成熟，比较观察各组及各菌株菌丝球大小、浓密、菌液状况[8]；

1.3.4 栽培出草及菌种性能分析 将成熟后的液体菌种，按培养基体积的约10%接种量接入栽培出草培养基（本试验接入量均为6 mL），置于人工气候箱中适宜条件下培养[9]，比较观察各组及各菌株在菌丝萌发、生长、转色、出草、子实体形态、产量等方面表现出的菌种性能及规律。以出草产量及质量为主要指标，分析探究不同提纯复壮方法对菌种性能的影响、趋势及规律。试验以优质原始蛹虫草母种为对照（Y0），5个重复（编号1～5）；各试验组制备复壮菌种20个菌株（编号1～20）；各菌株栽培出草10瓶重复。

2 结果与分析

2.1 原始母种培养性能及栽培出草

原始母种平板培养、液体培养及栽培出草结果见表1。从表1可以看出，Y0组各菌株于试管斜面避光培养阶段均表现为洁白、浓密、健壮，紧贴斜面匍匐状生长，气生菌丝少，形态基本一致。

2.2 组织分离法复壮菌种性能及栽培出草

Y1组各菌株平板及液体培养特征、栽培出草情况见表2。从表2可以看出，各菌株于试管斜面均表现为洁白、匍匐状，仅20号菌株长势较差，菌丝较瘦弱、稀少，其余各菌株与优良亲本母种形态较为一致。

从表2可以看出，Y1组各菌株平板避光及见光培养表现出一定性状差异。其中1～18号原洁白、健壮、浓密、匍匐状菌株，平板培养菌落形态、生长速度、转色程度等与Y0组基本一致，出草结果亦与Y0组较为接近；仅19及20号菌株转为淡黄色，前者出草能力显著低下、后者不能出草。结合表1，显然与其转色性能较差有关。14号菌株生长速度较快，出草量亦较高。从各菌种菌株液体培养情况来看，1～18号菌株菌液细密黏稠，与其菌丝生长较快性能相一致，说明其液体培养生物量较高，因而出草形态较好、产量亦较高。从该组各菌株整体情况看，试管及平板避光培养，菌丝洁白、健壮、浓密、匍匐状，则生长速度较快，见光培养转色性能较好，液体培养菌丝球细密、菌液黏稠，出草性能较好；尤其转色性能与出草结果有较大的一致性，说明菌丝洁白、健壮、浓密、匍匐状，液体培养菌丝细密黏稠，尤其转色性能良好，是优良菌种的重要表现。试验中也观察到，瘦弱、绒毛状菌株生长较慢，转色性能较差，生物量显著低于其他菌株，栽培出草过程菌丝吃料缓慢、不出草。

2.3 单子囊孢子配对复壮菌种性能及栽培出草

单子囊孢子配对复壮菌种各菌株平板、液体培养及栽培出草情况见表3。从表3可以看出，Y2组各菌株于母种斜面阶段即较Y1组菌株性状分化明显。其中，1～17号菌株菌丝洁白、健壮、浓密、匍匐状，18、19号菌株气生菌丝较明显、瘦弱，长势较差；20号菌株气生菌丝明显，呈绒毛状且色较暗。

从表3可以看出，1～16号菌株平板培养仍保持母种匍匐、浓密状性状，生长较快，绝大部分菌株转色性能较好，液体培养菌液细密黏稠，出草量亦较高。进一步说明菌丝洁白、健壮、浓密、匍匐状生长较快、可良好转色及菌液黏稠细密，是菌种优良性状表现。其中，7、8、11及6号菌株生长较迅速、转色明显较快、较深，菌液亦较黏稠细密，出草量亦明显超过对照组，可达19～21 g/瓶的较高水平；而9、4号菌株尽管菌丝生长速度高于7、8和11号菌株，但由于不转色或转色淡，不出草。16～20号菌株母种斜面或平板培养即已表现出稀疏、瘦弱、气生菌丝较多、绒毛状、色暗或生长较缓慢等不良性状，光照培养转色淡或不转色，液体培养大都菌丝球粗大、菌液较清澈，栽培不出草。显然较Y1具有更强的变异性及两极分化趋势，其中部分菌株更优，有利于复壮和选育更优菌株。

2.4 复壮菌种性能与出草结果分析

出草产量及子实体形态是菌种性能的根本体现。试验结果表明，Y1及Y2组各菌株出草产量及子实体形态表现有明显差异，产量较高者，草体形态典型；产量较低者，草体矮小、分叉、丛枝等畸形；以形态及产量与对照组相当或较接近为优良（大于15 g/瓶），草体明显畸形且产量明显较低为劣质（低于5 g/瓶），则Y1和Y2组出草结果差别明显。Y1组出草率高达95%，且优质草率达85%，劣质及不出草率10%；而Y2组出草率仅达约60%，但草体大多形态典型、产量较高。进一步跟踪各组各菌株试管斜面、平板及转色培养、实际栽培出草等菌种性能，可以看出，尽管Y1及Y2复壮方式不同，其试管斜面培养、平板生长及转色、液体培养、栽培出草特征及其优良率均呈一定下降趋势，其中良好转色一般可获得较好出草结果。分析其原因，菌种菌株避光培养菌丝洁白、浓密、健壮，紧贴培养基表面匍匐生长，气生菌丝少，生长迅速，则有利于菌丝体从培养基质内部吸收充足营养；液体培养菌丝球细密、菌液黏稠，则菌丝细胞较多、代谢旺盛而易于积累相关物质，为见光转色、出草等生殖生长奠定了良好的基础。良好转色是生殖生长的重要标志，是出草等生殖生长过程的重要环节和基础[9，10]。菌丝洁白、浓密、健壮、匍匐状生长快、见光转色好、转色快、转色深，则菌种萌发快、满瓶时间短、出草形态好、产量高；相反菌丝瘦弱、灰暗、气生菌丝多、转色浅则不出草或为劣质草，尤其不转色则不出草，与菌种培养性能基本相吻合。说明菌种固体及液体培养特征是菌种性能的基本体现，其中良好转色是栽培出草的重要基础。其中，Y2组中4株菌株其菌种性能及产量明显高于对照组，可用于选育、提纯及复壮更优菌株。

3 小结与讨论

组织分离法及孢子配对法是丝状真菌菌种分离及良种选育的主要方法。锁现民等[5]、杨玉红等[6]研究结果表明，以蛹虫草子实体中上部及尖端组织作分离材料，菌种性能较佳，本试验鉴于蛹虫草菌丝性能易于退化，以菌丝组织形成较晚的子实体中上部为分离材料，证实以其提纯及复壮菌种，出草优良率可达85%，说明组织分离法可较好地保持和遗传母本优良性状，且操作较为简便，可作为一般蛹虫草种植户及优质蛹虫草菌种分离、筛选及提纯复壮的方法。同时试验结果还表明，以单子囊孢子配对方式制备及复壮菌种，尽管不出草比例可高达约40%，但出草菌株大多形态典型、产量较高，更优菌株比例可达约20%，与潘葳[10]、高新华等[11]的研究结果基本一致。梁宗琦[12]、高新华[13]研究证实，蛹虫草为二极性异宗配合，潘葳[10]、高新华等[11]、梁月等[14]进一步证实少数单子囊孢子在适宜条件下仍可正常出草、存在“假同宗配合”等现象，说明尽管蛹虫草有性生殖过程复杂，但仍应以单子囊孢子配对作为筛选、复壮和选育更优菌株的主要方法。试验还进一步表明，在菌种分离、复壮及良种选育过程中，可选取菌丝浓密、健壮、匍匐状，气生菌丝少，生长迅速，转色快且深，作为优良菌种初步筛选的主要指标，但仍应以栽培出草试验作为菌种性能鉴定的根本依据。

致谢：本文在荆楚理工学院生物工程学院方华舟老师指导下完成，孙露露、谈晶等同学亦做了大量的试验工作，在此一并表示感谢！

参考文献：

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