miR-30a抑制人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力

张汝益，何 方，王 静，邓 芳，李琪英，施 琼*

(重庆医科大学 1.检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室； 2.麻醉系， 重庆 400016)



研究论文

miR-30a抑制人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力

张汝益1，何 方1，王 静1，邓 芳1，李琪英2*，施 琼1*

(重庆医科大学 1.检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室； 2.麻醉系， 重庆 400016)

目的探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B侵袭、迁移和细胞活力的影响。方法过表达或抑制miR-30a分别处理人骨肉瘤细胞143B。划痕实验观察细胞划痕愈合能力；Transwell实验检测143B细胞迁移和侵袭能力；MTT实验检测细胞活力；定量PCR实验确认过表达miR-30a腺病毒有效性并且检测RUNX2 mRNA表达；Western blot检测细胞中RUNX2总蛋白表达。结果过表达miR-30a抑制了骨肉瘤细胞143B迁移和侵袭(P<0.05)，在72 h时，miR-30a明显抑制细胞活力(P<0.01)；抑制miR-30a的内源性表达后，143B细胞的迁移和侵袭能力增加(P<0.05)，细胞活力也表现出上升水平(P<0.01)；同时过表达miR-30a可以抑制RUNX2的蛋白表达，抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表达增加(P<0.05)。荧光素酶活性检测，miR-30a可以靶向于RUNX2(P<0.01)。结论miR-30a抑制骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力，其作用可以能是通过抑制RUNX2的表达来实现。

miR-30a；人骨肉瘤细胞；RUNX2

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是起源于间叶组织的恶性肿瘤[1]。自上世纪80年代采用联合治疗策略以来，骨肉瘤患者的5年生存率大幅提高，不过近十年来虽然有不同的治疗药物问世，患者5年生存率相比前十年却没有明显变化[2- 3]。如何改善病人的生活质量并且提高5年生存率成为科学家致力研究的问题[4]。

MicroRNA是一类长度在19～25 bp的短链非编码RNA,其作用主要是对转录后的RNA进行表观遗传水平的调控[5]。MicroRNA可以调节肿瘤细胞的增殖、分化，并且可以抑制或促进肿瘤的远处转移[6]。正是因为MicroRNA具有这些特性，使它成为潜在治疗肿瘤的基因药物[7]。本研究通过使用过表达miR-30a的腺病毒和特殊的Inhibitior抑制miR-30a，从正反两方面探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭性和活力，并对其机制作初步探索，以期为临床提供一些依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和病毒:人骨肉瘤细胞系143B和人胚肾细胞系HEK- 293(ATCC)。重组腺病毒Ad-RFP和Ad-miR-30a(本实验室构建保存)。

1.1.2 主要试剂：DMEM高糖培养基和胎牛血清(Hylcone公司)；PCR反转录试剂、定量PCR试剂和内切酶和T4连接酶(TakaRa公司)；PCR引物和Trziol(Invitrogen公司)；Transwell小室和Western blot ECL显影剂(Millipore公司)；抗RUNX2抗体和β-actin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：HEK-293和143B细胞均培养于含有10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基。置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 实验分组及处理: 实验组分为空白组(blank)、对照组(Ad-RFP)、过表达miR-30a(Ad-miR-30a)组；miR-30a抑制组(转染mrR-30a inhibitor，In-miR-30a)，抑制剂对照组(转染无义inhibitor，In-control)组。Ad-RFP和Ad-miR-30a感染效率在30%左右为宜。

1.2.3 划痕实验：将总数为1.5×105个/孔的143B细胞悬液接种于6孔板，待细胞汇合度达90%时，使用200 μL Tip头横竖各划4条痕。测量多个划痕点宽度，计算各组划痕愈合率[(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%]，重复3次取平均值，比较各组细胞迁移能力。

1.2.4 Transwell实验：取对数生长期143B细胞制成悬液，将400 μL的7.5×104个/mL细胞悬液加入到铺有基质胶或没有铺基质胶的上室，24孔板下室加入含20%胎牛血清的培养基600 μL。24 h后染色置显微镜下计数并照相。

1.2.5 MTT实验：取对数增殖期细胞悬液，以3 000个/孔细胞数加入到96孔板，12 h后换低血清培养基，并加处理因素，此时计时为0 h，此后在24、48和72 h时间点再次检测。到时间点后，各孔加入MTT试剂20 μL，继续培养4 h，小心吸走培养基，加入150 μL/孔DMSO,置摇床避光慢摇10 min，酶标仪检测吸光度。

1.2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验：各组细胞使用Trizol提取RNA，然后反转录成cDNA。反应体系如下：cDNA 2 μL，SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.4 μL，Total 20 μL。

1.2.7 Western blot： 细胞裂解，离心取上清，BCA方法检测蛋白浓度，加入缓冲液煮沸5 min置-20 ℃冰箱备用。经10% SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。加入一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃冰箱过夜。第2天预冷TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶5 000稀释)，37 ℃反应1 h，再次用预冷TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL显影成像。

1.2.8 双荧光素酶报告基因检测：软件预测到的各个靶基因位点加上Hind Ⅲ和Spe I酶切位点后用T4连接酶连接到报告载体上。使用Lipofectamine 2000将阳性质粒和对照质粒导入到293细胞中，36 h后检测荧光素活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 病毒感染效率和抑制剂转染效率

加入miR-30a和Ad-RFP病毒到143B细胞36 h后,相对Ad-GFP组，miR-30a表达显著增加(图1A,B)。转染经过荧光标签修饰过的miR-30a的抑制剂24 h荧光显微镜下的图像,转染效率几乎达到100%(图1D)。

2.2 划痕实验检测miR-30a对143B细胞迁移的影响

Ad-miR-30a组划痕愈合率为(53.40%±3.05%)显著低于Ad-RFP组的(76.55%±1.16%)和空白组的(80.45%±2.78%) (P<0.05)。而加入抑制剂抑制miR-30a后，143B细胞24 h的划痕愈合率(100%)明显比加入无义inhibitor的细胞或者没有加处理因素的143B细胞的划痕愈合率升高(图2)。

2.3 Transwell检测miR-30a对143B细胞迁移、侵袭的影响

感染腺病毒Ad-miR-30a后,穿过小室膜的细胞明显比Ad-GFP和空白组少(P<0.05)，但是In-miR-30a组穿出的细胞比In-control组和空白组明显增多(P<0.05)。铺基质胶，模拟体内肿瘤细胞侵袭过程，加入Ad-miR-30a，143B细胞穿膜数显著下降，而使用i抑制剂抑制miR-30a后，143B细胞穿膜数显著上升 (P<0.05)(图3)。

2.4 MTT检测miR-30a对143B细胞活力的影响

在24，48和72 h分别检测了143B细胞的活力，过表达miR-30a在72 h过可以明显降低143B活力，而抑制miR-30a后143B细胞活力相对空白组升高(P<0.01)(图4)。

2.5 寻找miR-30a的靶向基因

通过预测软件对miR-30a的靶基因进行预测，找到RUNX2这个靶基因。qRT-PCR并且对产物进行琼脂糖凝胶电泳，RUNX2 mRNA表达在几组细胞里无明显变化(图5A)。过表达miR-30a后RUNX2蛋白表达下降，抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白表达增加。

A. 143B cells infected with Ad-miR-30a; B.143B cells infected with Ad-RFP; C.investigated adenovirus miR-30a expression mature miR-30a; D.143B cells were transfected with miR-30a inhibitor;*P<0.05 compared with blank

图1 验证过表达miR-30a的腺病毒和抑制miR-30a的抑制剂的有效性

Fig 1 To identify the effectiveness of Aα-miR-30a and its in hibitor(×40)

图2 划痕实验检测miR-30a对143B细胞迁移的影响

*P<0.05 compared with control group

*P< 0.01 versus control cells图4 MTT检测miR-30a对143B细胞活力的影响Fig 4 The effects of miR-30a on 143B cell viability

A.PCR; B.Western blot图5 miR-30a对Runx2 mRNA和蛋白水平的影响Fig 5 Effect of miR-30a on RUNX2 mRNA and protein levels

2.6 miR-30a靶向RUNX2 3′-UTR

miR-30a显著抑制RUNX2 3′-UTR第3个靶位点荧光酶活性(P<0.01)(图6)。

3 讨论

自1993年第一个MicroRNA鉴定完成以来[8]，截止作者发稿时已经有24,521个MicroRNAs被列入数据库miRBase。如此多的MicroRNAs被人们发现足见其重要性。

本研究对象miR-30a不仅可以调节成骨分化，在乳腺癌、胃癌和子宫内膜癌等癌症中也有异常的表达水平。骨肉瘤的主要发生机制就是骨组织成骨、破骨功能紊乱，青春期人体开始二次发育，骨骼也随之快速增长，特别是股骨远端和胫骨近端的生长更是决定一个人的身高水平， 而骨肉瘤的好发部位也正是在这两个地方[9]。本研究利用腺病毒过表达miR-30a后骨肉瘤细胞143B的迁移和侵袭明显受到抑制，而用特异性抑制剂抑制miR-30a后143B细胞的迁移和侵袭能力大大提高，提示骨肉瘤细胞143B的迁移和侵袭受到miR-30a的调控。为了阐明miR-30a调控143B细胞的具体机制，利用靶基因预测软件对miR-30a的靶基因进行了预测，找到了RUNX2这个潜在靶基因。相关研究表明，RUXN2可以调控TLN1和PTK2而控制骨肉瘤细胞的运动活力[10]。也有研究发现RUNX2的表达和骨肉瘤的转移有很大的相关性[11]。本实验也发现过表达miR-30a后RUNX2的蛋白水平下降，说明RUNX2是miR-30a的一个靶基因，这与前人的报道一致[12]。综上，通过本研究说明miR-30a抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭并且可能是通过靶向RUNX2来实现。

*P< 0.01 compared with no-miR group图6 荧光素酶报告基因实验检测miR-30a是否靶向于RUNX2基因3′-UTRFig 6 Luciferase activity in 293 cells

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miR-30a suppresses migration, invasion and vitality of human osteosarcoma cell line 143B

ZHANG Ru-yi1, HE Fang1, WANG Jing1, DENG Fang1, LI Qi-ying2*, SHI Qiong1*

(1.Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics,Ministry of Education,College of Laboratory Medicine; 2.Dept. of Anesthesiology, Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effect of miR-30a on human osteosarcoma cell 143B in migration,invasion and cell viability. Methods 143B cells were infected or transfected with recombinant adenovirus miR-30a (Ad-miR30a) and miR-30a inhibitor respectively. Wound healing assay was performed to detect the cell healing ability(P<0.05). Cell migration and invasion ability were determined by Transwell assay(P<0.05).The cell viability was analyzed by MTT assay(P<0.01). Real-time quantitative PCR was performed to analyze the expression ofRUNX2 mRNA level and confirmed the adenovirus miR-30a expressed in 143B cells.The expression of RUNX2 was analyzed by Western blot. miR-30a target toRUNX2 was verified by luciferase reported gene assay. Results The ability of migration and invasion was suppressed in osteosarcoma cell 143B by overexpression miR-30a,and the cell viability also decreased.After the endogenous miR-30a being inhibited, the cell motility and invasion enhanced and the cell viability was promoted.The RUNX2 protein decreased after overexpression miR-30a as compared with control group. The luciferase activity ofRUNX2 decreased by adding miR-30a.Conclusions 143B cell migration,

invasion and viability were suppressed by miR-30a,and this process is potentially achieved via suppressing RUNX2 protein expression.

miR-30a; human osteosarcoma cell line; RUNX2

2014- 06- 09

2014- 10- 08

国家自然科学基金(31200971)

1001-6325(2015)01-0012-05

R738.1

A

*通信作者(corresponding author)：anniesq8718@aliyun.com; alny68@163.com