GLUT1和Claudin-4在胸水转移性肺腺癌细胞及反应性增生间皮细胞中的表达

汪露祥，陈 龙，吴献忠，谢翠艳，蒋 振，方 威，钟善传

(1.黄山市人民医院 病理科，安徽 黄山 245000，2.解放军第532医院 病理科，安徽 黄山 245000)

胸水细胞形态多样，有时腺癌细胞仅表现出轻度的异型性，而反应性间皮细胞却可能表现出重度的异型性，在常规胸水细胞学检查中，反应性间皮细胞及转移性肺腺癌细胞的鉴别诊断是胸水细胞学诊断的难点。胸水检查出恶性细胞，对患者的临床处理和预后判断都具有重要意义，因此，区分反应性间皮细胞及转移性腺癌具有重要临床价值。近年来，许多免疫标记物应用于胸水细胞蜡块的辅助诊断。然而，到目前为止还没有发现一个具有足够灵敏度和特异性的标志物，多种抗体的联合应用辅助胸水细胞学诊断成为研究热点。葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是介导哺乳动物细胞葡萄糖转运的主要载体，其中GLUT1是目前已知体内分布最为广泛的葡萄糖转运体。近年来，不断有报道认为GLUT1表达于许多恶性肿瘤，而在反应性增生间皮细胞中不表达。Claudin-4是一个紧密连接相关蛋白，在上皮细胞中广泛表达，而在间皮细胞中表达缺失。最近的研究表明，Claudin-4在鉴别肺腺癌细胞和间皮瘤细胞中具有重要意义。本研究在细胞蜡块的基础上，行免疫组化联合检测GLUT1和Claudin-4，鉴别反应性增生间皮细胞和转移性肺腺癌细胞，弥补单纯细胞学检测的局限性，为临床诊断、治疗及判断预后提供更为可靠的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集安徽省黄山市人民医院病理科2011年12月～2014年12月胸水病例共55例，其中转移性肺腺癌30例，男性16例，女性14例，年龄45～77岁(中位年龄57岁);反应性增生间皮细胞胸水患者25例，男性13例，女性12例，年龄52～73岁(中位年龄58岁)。所有病例均经活检或组织病理检查明确诊断。

1.2 细胞切片的制备 收集新鲜胸水标本200 mL左右，室温下3000 r/min离心10 min。取沉渣表层细胞，经福尔马林固定，石蜡包埋制成细胞块。切片3张，1张用于HE染色，常规细胞学检查;另2张分别用于GLUT1和Claudin-4免疫组化染色。

1.3 免疫组化染色 免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法。石蜡切片厚2～3 μm，操作按试剂盒说明书进行，胸水红细胞作为GLUT1内源性阳性对照，已知Claudin-4阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。GLUT1抗体购自福州迈新生物有限公司，Claudin-4抗体购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.4 结果判定方法 GLUT1和Claudin-4阳性颗粒均呈棕黄色，阳性表达主要定位于胞膜，胞质偶有弱表达，两者均在细胞连接处更为明显。无色、染色浅与背景几乎一致及高倍视野下阳性细胞占同类细胞的5%以下为阴性;阳性染色占6% ～25%为(+)，26% ～50% 为()，51% ～75% 为)，75%以上为()。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，两组间比较采用χ2检验。GLUT1和Claudin-4联合检测的灵敏度和特异性采用平行试验方法。

2 结果

2.1 胸水细胞块GLUT1免疫组化染色结果 肺腺癌细胞GLUT1呈强阳性表达，呈棕黄色颗粒外观，主要定位于胞膜，红细胞也呈强阳性表达(图1)。30例肺腺癌细胞中有28例癌细胞GLUT1呈阳性表达，占93.3%。25例反应性增生间皮细胞胸水患者中只有1例呈弱阳性表达(+)，占4%，且为胞膜淡浅着色。转移性肺腺癌细胞与反应性增生间皮细胞的GLUT1阳性率具有显著性差异(P＜0.01)，见表1。

图1 GLUT1在肺腺癌细胞中的表达

2.2 胸水细胞块Claudin-4免疫组化染色结果Claudin-4在29例(29/30)肺腺癌细胞中呈阳性表达，大部分呈膜弥漫强阳性(图2)，少部分呈膜中等强度染色。25例反应性增生间皮细胞中仅1例呈弱阳性(+)，占4%，其余24例均为阴性。转移性肺腺癌细胞与反应性增生间皮细胞的Claudin-4阳性率具有显著性差异(P＜0.01)，见表2。

图2 Claudin-4在肺腺癌细胞中的表达

表1 胸水细胞GLUT1免疫组化染色结果

表2 胸水细胞Claudin-4免疫组化染色结果

2.3 GLUT1和Claudin-4联合检测在胸水中的诊断价值 从GLUT1和Claudin-4在胸水细胞的免疫组化结果来看，大部分肺腺癌细胞GLUT1和Claudin-4均呈阳性，而反应性增生间皮细胞GLUT1和Claudin-4呈阴性。通过计算两者联合检测的结果，二者平行法检测对转移性肺腺癌诊断的灵敏度为100%，特异性为92.0%。见表3。

表3 联合检测GLUT1和Claudin-4对肺腺癌诊断的灵敏度和特异性

3 讨论

在胸水细胞学诊断中，常规细胞学涂片具有简捷方便、快速经济等优点，但是由于涂片方法本身的局限性容易造成细胞厚薄不均、结构不清，甚至出现人工假象，给诊断带来干扰。近年来，液基细胞技术在胸水中的应用大大提高了细胞制片的质量。然而，转移性腺癌细胞与反应性增生间皮细胞有时在形态上十分相似，仅靠细胞学形态往往不足以诊断，需要进一步检查才能明确诊断。当胸水内的癌细胞仅表现为轻度的异型性时，常与反应性间皮细胞相混淆，导致临床高度怀疑恶性的胸水标本，反复的细胞学检查结果却未见恶性肿瘤细胞。近年来，以细胞蜡块为基础的免疫组化染色不断应用于细胞学诊断。本研究利用细胞蜡块技术，通过免疫组化方法联合检测GLUT1和Claudin-4，评估它们对胸水转移性肺腺癌与反应性增生上皮细胞的鉴别诊断价值。

GLUT1是目前已知体内分布最为广泛的葡萄糖转运蛋白，绝大多数组织细胞不能独立运输葡萄糖，需借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白通过易化扩散方式顺浓度梯度运输葡萄糖［1－3］。研究表明，GLUT1仅在少量正常组织中表达，包括在红细胞、睾丸生精细胞、肾小管、周围神经束膜、血脑屏障的血管内皮细胞以及胎盘的滋养层和血管，在反应性增生间皮细胞中不表达［4］。肿瘤细胞的主要特点是持续快速的增殖，这种增长方式必然导致细胞对葡萄糖摄取增加以满足自身代谢需要。研究表明，GLUT1在上皮源性恶性肿瘤中广泛表达，如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾细胞癌以及一些头颈部肿瘤，另外，GLUT1 在恶性间皮瘤中也呈阳性表达［1，5］。这些都提示GLUT1可能作为恶性肿瘤的分子标志物。因此，在胸水细胞中GLUT1表达阳性提示上皮性肿瘤细胞转移或恶性间皮瘤。本研究表明，GLUT1在胸水转移性肺腺癌的灵敏度为93.3%，特异性为96.0%，可作为鉴别转移性肺腺癌细胞与反应性增生间皮细胞的分子标志物。

Claudins是细胞间紧密连接骨架蛋白，有维持细胞极向排列的功能，而上皮性肿瘤的一个重要形态学特征就是瘤细胞的排列极向消失，因此，Claudins与上皮性肿瘤关系密切。另外，紧密连接完整性丧失造成癌细胞的凝聚力降低及侵袭性增加，也是肿瘤转移进程中重要的一步［6］。Claudin-4是Claudins家族的主要成员之一，主要分布在肺、肾、小肠、结肠和脑组织中。近年的研究表明，Claudin-4在原发性卵巢癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、胆管癌、子宫内膜癌、膀胱癌及前列腺癌等一系列恶性肿瘤中表达显著增高，而在胸腹水反应性增生间皮细胞中不表达，提示Claudin-4可用于鉴别腺癌细胞与反应性增生间皮细胞［7］。我们的研究表明，Claudin-4在胸水转移性肺腺癌细胞的灵敏度为96.6%，特异性为96.0%，是鉴别胸水转移性肺腺癌与反应性增生间皮细胞的一个很好的指标。

在目前的临床病理诊断工作中，CK7(Cytokeratin 7，细胞角蛋白7)和 TTF-1(Thyroid transcription factor-1，甲状腺转录因子-1)作为常规肺腺癌标记物，而CR(Calrentinin，钙结合蛋白)和MC(Mesothelial cell，间皮细胞蛋白)作为间皮细胞标记物。有研究者对它们在鉴别胸水转移性肺腺癌细胞与反应性间皮细胞的意义进行分析，结果显示，CK7与TTF-1联合标记对肺腺癌细胞的灵敏度为88%，特异性为100%;CR与MC联合标记对反应性间皮细胞的灵敏度为60%，特异性为95%［8］。我们通过联合检测胸水GLUT1和Claudin-4在肺腺癌细胞与反应性增生间皮细胞的表达情况，发现具有两个重要意义。首先，GLUT1和Claudin-4均表现为高度的灵敏度和特异性，二者联合标记对胸水转移性肺腺癌细胞的灵敏度和特异性分别为100%和92.0%，优于常规CK7、TTF-1、CR和 MC四种抗体的联合检测，为临床病理诊断提供了更好的选择。其次，根据文献报道，GLUT1 表达于恶性间皮瘤［1，5］，而 Claudin-4不表达［9］。因此，GLUT1和 Claudin-4联合检测可能对于胸水转移性肺腺癌细胞、恶性间皮瘤细胞和反应性增生间皮细胞的诊断和鉴别诊断都具有重要意义，有待更深入的研究。本研究为下一步的研究工作提供了重要的基础资料。

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