霉酚酸酯对糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞的保护作用

刘 磊，常保超，陈 峥，吴雪平，杨丽娟

(1.蚌埠医学院第一附属医院 肾内科，安徽 蚌埠 233004;2.蚌埠医学院 生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

肾小球滤过膜是维持肾脏滤过功能的重要结构，其中，由足细胞的足突及其裂隙膜构成的最外层的结构最为复杂，功能也最为重要，Nephrin是裂孔膜“拉链”结构的主要成分，也是肾小球滤过膜存在分子选择性的基础［1－2］。近年来，有许多研究发现足细胞及相关蛋白Nephrin表达异常是糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)蛋白尿发生的重要机制。霉酚酸酯(mycophenolate mofeti，MMF)能强有力地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，目前作为免疫抑制剂在临床上使用，新近有研究表明MMF干预治疗糖尿病肾病大鼠，治疗后大鼠高尿蛋白、肾小球高滤过、肾小球硬化及巨噬细胞浸润程度均有所好转［3］。本研究探讨MMF是否通过调节Nephrin表达减少糖尿病肾病大鼠尿蛋白及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠30只(购自蚌埠医学院动物中心)，随机分为正常对照(NC)组(10只)、DN组(10只)、MMF组(10只)。用链脲佐菌素制作糖尿病肾病大鼠模型，DN、MMF组腹腔注射60 mg/kg STZ(以pH 4.2的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制)，NC组注射同浓度的枸橼酸缓冲液作为对照，腹腔注射STZ 3 d后进行空腹血糖的测量，连续测量3 d，血糖＞16.7 mmol/L定为糖尿病肾病大鼠模型;造模成功后，MMF组给予MMF 15 mg/(kg·d)灌胃［4］，NC组、DN 组给予同等量的生理盐水灌胃，早晚各灌1次。所有大鼠按分组分笼，按清洁级动物饲养，饲养周期为8周。

1.1.2 药物 链脲菌素(STZ，美国 Sigma);MMF(杭州中美华东);枸橼酸、2%戊巴比妥钠、10%中性甲醛液(上海化学试剂厂)，链酶菌抗生物素-过氧化物酶溶液(福州东旗);羊抗大鼠多克隆抗体Nephrin、兔抗大鼠单克隆抗体 MCP-1(武汉博士德)。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 各组大鼠饲养8周后分别置于代谢笼中收集24 h尿液，检测尿蛋白定量;处死动物，收集血标本检测血糖、肾功能，测量肾质量/体质量;留取肾标本分别进行病理、免疫组化及逆转录PCR检测。

1.2.2 病理学检查 部分肾组织经10%甲醛固定，制成4 μm厚切片，行HE染色观察肾小球病变;部分肾皮质经固定，切片50 μm，行电镜观察。

1.2.3 免疫组织化学检查 采用SABC技术，将石蜡固定标本制成4 μm厚切片，经脱蜡及抗原修复后，切片分别与羊抗大鼠多克隆抗体 nephrin(1∶200)、兔抗大鼠单克隆抗体 MCP-1(1∶200)4℃孵育过夜。缓冲液冲洗后，滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育2O～30 min。再次缓冲液冲洗3次，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。以HPLAS-400图像分析系统对肾组织免疫组化结果行半定量分析，每张标本按顺序选5个肾小球，对所选视野内的免疫组化阳性信号进行图像分析，以阳性目标总面积占统计场总面积的百分比表示。

1.2.4 逆转录PCR检测 用TRIzol一步法提取组织总RNA，于260 nm和280 nm处测定其OD值，计算OD260/OD280比值，观察纯度。取总RNA 3 μL为模板，用随机引物逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。Nephrin(94bp)正义序列5'-CCCGGACACCTGCATGATG-3'，反义序列 5'-GCTGCCACCTGGTCGTAGATT-3'。扩增条件:95℃预变性3 min后，以①95℃ 50 s变性;②退火温度62℃ 30 s;③72℃ 60 s，反应30个循环，最后一轮延长时间至10 min。MCP-1(146 bp)正义序列5'-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3'，反 义 序 列 5'-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3'。扩增条件:95℃预变性3 min后，以①95℃ 50 s变性;②退火温度58℃ 30 s;③72℃60 s，反应30个循环，最后一轮延长时间至10 min。取PCR产物5 μL在15%的琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像系统(Bio-Rad公司)上扫描，测定各目的基因吸光度值，分别计算其比值。

1.3 统计学方法 计量资料采用均数±标准差表示，多组间采用F检验，两两比较采用q检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 一般指标 结果显示，DN组和MMF组大鼠出现消瘦，毛发萎黄，体质量较NC组明显下降，而MMF组较DN组大鼠体质量偏高;DN组和MMF组大鼠肾质量/体质量较NC组升高，且差异有高度统计学意义(P＜0.01);DN组和MMF组大鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Scr和FBS较NC组升高，且差异有统计学意义(P＜0.01)。具体情况见表1。

2.2 病理学改变 光镜下经PAS染色可见DN组及MMF组大鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，肾小球毛细血管腔受压变窄，NC组无明显变化，而其中MMF组较NC组变化较轻，有一定程度的改善。电镜结果显示，DN组大鼠肾小球足突融合变平，可见部分基底膜裸露，部分足细胞脱落，MMF组大鼠较DN组足突融合减轻，足细胞脱落减少，而NC组无变化。见图1。

表1 3组大鼠尿蛋白定量、血糖、血肌酐、尿素氮、肾质量/体质量(±s)

表1 3组大鼠尿蛋白定量、血糖、血肌酐、尿素氮、肾质量/体质量(±s)

注:与 NC 组相比*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，与 DN 组相比△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 n 尿蛋白定量(g) Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) FBS(mmol/L) KW/BW(×10－3)NC 10 4.85 ±1.02 32.00 ±5.33 6.69 ±1.78 6.10 ±1.0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 23 2.80 ±0.34 DN 10 44.72 ±6.00＊＊ 71.80 ±5.86＊＊ 34.41 ±4.98＊＊ 27.41 ±4.44＊＊ 5.00 ±1.01＊＊MMF 10 24.37 ±5.12＊＊△△ 39.60 ±6.48＊＊△△ 16.74 ±3.92＊＊△△ 24.65 ±5.13＊＊ 3.54 ±0.64＊△△F 188.478 127.872 136.336 84.747 24.329 P

图1 光镜下及电镜下3组大鼠肾脏组织病理变化

2.3 免疫组化改变 NC组可见Nephrin蛋白均匀分布于肾小球基底膜，DN组Nephrin蛋白表达减少，呈颗粒状不均匀分布，MMF组Nephrin表达较DN组改善，呈不均匀分布，部分可见颗粒样中断。DN组MCP-1蛋白表达增加，MMF组MCP-1蛋白表达减少，两组相比有统计学意义(P＜0.01)。见图2和表2。

图2 经免疫组化处理后3组大鼠肾脏组织中Nephrin、MCP-1的表达

表2 各组大鼠肾组织中Nephrin、MCP-1的表达(%)

2.4 RT-PCR检测Nephrin及MCP-1mRNA表达变化 与NC组大鼠相比，DN组大鼠肾组织MCP-1mRNA表达显著升高，Nephrin mRNA表达明显下降(P＜0.01);经MMF干预治疗后，MMF组大鼠MCP-1mRNA表达减少，Nephrin mRNA表达增加(P＜0.05)。见图 3。

图3 RT-PCR检测Nephrin及MCP-1mRNA表达变化

3 讨论

近年来，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率迅速增加，对人类健康造成重大危害。DN是DM最常见和最严重的并发症，其发病率逐年上升，已成为终末期肾脏病的主要病因之一。DN的特征是大量蛋白尿，有研究揭示DN的发病与肾脏足细胞病变密切相关［5］。糖尿病伴微量白蛋白尿患者的肾脏足细胞特异蛋白Nephrin、α3β1整合素表达显著下降，并与蛋白尿程度呈负相关［6－7］。DN后期足细胞脱落、凋亡增加和缺乏再生能力等导致足细胞的密度和数量减少;足细胞单层结构破坏影响裂孔膜的完整性以及细胞间的连接和细胞糖萼蛋白丢失，使白蛋白和其他分子滤过增加，导致DN蛋白尿的发生［8－9］。单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是公认的炎症指标。Han等［10］报道MCP-1由肾小球足细胞合成，并在肾小管间质中发现，MCP-1属于CC趋化因子家族，可诱导单核/巨噬细胞浸润肾小球、肾间质细胞中，促进基底膜和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增生，加速肾小球硬化和肾间质纤维化，加快DN进展［11］。霉酚酸酯(MMF)治疗后糖尿病肾病大鼠肾组织MCP-1表达明显降低，萎缩肾小管及间质纤维化明显减少，并可减轻蛋白尿;不论从基因水平还是从蛋白水平，MMF均可抑制MCP-1的表达抑制巨噬细胞的特异性趋化和增殖，减轻炎症反应，延缓DN的进展。糖尿病模型中MCP-1在肾小球中高表达，MCP-1的缺失可减轻蛋白尿及上调Nephrin蛋白的表达［12］。Nephrin在维持裂孔膜复合体结构和功能上发挥重要作用，是肾小球滤过膜屏障的重要组成部分。蛋白尿的产生与Nephrin表达下调密切相关［13］。本研究结果显示，DN组大鼠24 h尿蛋白、肾质量指数、Scr、BUN、FBS较NC组出现明显异常，病理下肾组织损害明显，MCP-1 mRNA表达明显增加，Nephrin蛋白在肾小球基底膜表达下降，与相关研究相符。

MMF是霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)的酯类衍生物，脱脂后形成具有免疫抑制活性的代谢产物MPA，从而发挥其生物学效应。MMF主要通过抑制淋巴细胞和单核细胞的增殖、减少抗体产生和细胞表面粘附分子的抑制，达到抗炎效果［14］。2003年Utimura等［15］首次在糖尿病模型中给予免疫抑制剂MMF干预，发现可明显减轻肾小球硬化与尿白蛋白排泄率增加，其机制主要为抑制肾内巨噬细胞浸润。国内外众多的实验证明，MMF可减少单核巨噬细胞浸润、肾间质成纤维细胞的活化及胶原沉积，延缓了RIF的进展［16］。新近有研究发现MMF干预治疗DN大鼠，大鼠尿白蛋白排泄和肌酐清除率显著下降、单核细胞/巨噬细胞浸润减少、肾组织的ECM增生减轻，起到了有效的保肾作用［17］。本研究结果显示，糖尿病肾病大鼠给予MMF组干预治疗后，大鼠一般情况改善。在给药第8周后体质量较DN组明显增高;24 h尿蛋白、肾质量指数、Scr、BUN、FBS较DN组明显降低;肾组织病理检查损害明显减低。MCP-1mRNA在肾组织中的表达明显减少，Nephrin蛋白在肾小球基底膜表达明显增加。

综上所述，通过研究实验动物肾组织中MCP-1及Nephrin表达，揭示了炎症反应对糖尿病肾病发病及病情发展起了重要作用，MMF可通过抑制炎症反应来调节Nephrin的表达，从而保护肾脏足细胞，改善病情，为临床上治疗糖尿病肾病提供了新的方向。

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