鸡卵清提取液促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

阮光萍，刘菊芬，王金祥，何洁，杨建勇，潘兴华

鸡卵清提取液促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

阮光萍，刘菊芬，王金祥，何洁，杨建勇，潘兴华

目的研究鸡卵清提取液是否有促进间充质干细胞增殖的作用。方法分离培养C57小鼠骨髓间充质干细胞，并用细胞增殖检测试剂盒检测培养基、PBS、HBSS和鸡卵清提取液不同终浓度、不同培养时间对细胞增殖的作用。结果鸡卵清提取液在不同终浓度、培养不同时间条件下，对细胞的促增殖作用都大于培养基、PBS和HBSS。结论鸡卵清提取液能促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖。

鸡卵清；C57小鼠；骨髓间充质干细胞；增殖

在细胞生物学研究中，发现一种提取液有促进细胞增殖的作用，对细胞培养的研究有重要意义。到目前为止，有一些关于鸡卵清提取液的研究报道，但还没有报道鸡卵清提取液有促进细胞增殖的作用[1-5]。本课题前期研究发现，鸡卵细胞提取液（卵清、全卵）有维持和增强细胞活性的作用[6]；继续研究发现，鸡卵清提取液起关键作用，而且获取方便，获得的提取液可在4℃稳定存放1个月以上，无需过滤除菌就能用于细胞培养。在本研究中，我们用C57小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSC）来进一步验证鸡卵清提取液对间充质干细胞是否有促增殖作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备DMEM-F12培养基和青链霉素双抗是Hyclone公司产品，胎牛血清是BI公司产品，细胞活力试剂盒（CellTiter 96 Aqueous OneSolution Cell Proliferation Assay）是Promega公司产品。其他试剂为国产分析纯，均在有效期内使用。细胞培养箱是上海力申科学仪器有限公司产品。SPF级C57小鼠5只，体重18~22 g，出生6~7 w，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京) 2009-0004]。

1.2 鸡卵清提取液制备取5个购自超市鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1∶1加裂解液，充分搅匀，冻于-20℃，反复冻融3次后，4600 r/min离心10min，取上清，4℃保存。裂解液配方：50mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L HEPES，pH 8.2，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.1 mmol/L、苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。在提取过程中注意无菌操作，提取获得的鸡卵清提取液无需再过滤除菌即可用于细胞培养。

1.3 C57小鼠BMSC培养C57小鼠颈椎脱臼处死，无菌取股骨，用生理盐水冲洗，用青链霉素双抗浸泡，用灭菌的小剪刀剪去股骨两端，用1 m l注射器吸培养基将股骨中的细胞冲出，然后离心，弃上清，用20%FBS的完全培养基培养；第2 d换液，以后每3~5 d换液，换液2~3次后，可见呈梭形贴壁生长的BMSC。待细胞长满后，可传代，第3代细胞用于增殖实验。

1.4 增殖实验将第3代C57小鼠BMSC消化下来，计数，调细胞浓度为1×105/ml，加入96孔板，四周的孔每孔加100μl PBS，可有效地防止蒸发。中间还剩6排，每排10孔。第1排每孔加50μl培养基，第2排每孔加50μl PBS，第3排每孔加50μl HBSS，第4排每孔加50μl鸡卵清提取液。要使加入的PBS、HBSS和鸡卵清提取液的终浓度分别为20%、25%和40%。在加之前用培养基调PBS、HBSS和鸡卵清提取液的浓度分别为40%、50%、80%，而用原液加入后，则终浓度为50%。培养不同时间后，每孔加入Promega的MTS试剂20μl，3 h后490 nm比色。

2 结果

2.1 C57小鼠BMSC的形态换液几次后，在倒置显微镜下可见C57小鼠BMSC呈梭形贴壁（图1A）。细胞长满后可传代（图1B）。

图1 C57小鼠BMSC的形态

2.2 不同培养条件下BMSC增殖能力检测结果不同终浓度鸡卵清提取液与C57-BMSC共培养不同时间后，对细胞的促增殖作用都大于培养基、PBS和HBSS。见表1。

3 讨论

在前期研究中，我们发现鸡卵清获取方便，无菌提取后，无需过滤除菌就能用于细胞培养。本研究用细胞增殖试剂盒对比平衡盐（PBS和HBSS）、培养基和鸡卵清提取液对细胞增殖的不同作用，检测它们对细胞活性的影响。结果表明，在不同终浓度、不同培养时间条件下，鸡卵清提取液促C57小鼠BMSC增殖的作用都比培养基的作用强，证明了鸡卵清提取液有促进间充质干细胞增殖的作用，在20%、25%、40%和50%终浓度时，培养2 d或3 d都促进细胞增殖，作用都比培养基强（P＜0.01），提示可将鸡卵清提取液作为间充质干细胞培养基的添加剂，有效地促进C57小鼠BMSC增殖。

在检测细胞增殖活性时，本研究采用进口的Promega细胞增殖检测试剂盒，不像传统的MTT方法，操作步骤麻烦耗时、影响因素多。而进口的Promega细胞增殖检测试剂盒只需一步，即每孔加入20μl试剂，不需吸掉上清，也不需振荡溶解沉淀，在37℃放置1~4 h就可以比色，所获结果比传统的MTT法更具有可比性。为了防止96孔板的边缘效应，我们用100μl PBS加到四周的孔中，可以有效防止蒸发，使结果更具可比性。

总之，鸡卵清提取液添加到培养基后，细胞增殖活性强于普通培养基，证明了鸡卵清提取液有可能成为一种间充质干细胞培养基中的有效添加剂，促进细胞活性与增殖。

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表1 不同培养条件下BMSC增殖能力检测结果(n=10)

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Extract from chicken ovalbumin promotes proliferation of C57mouse bonemarrow mesenchymal stem cells

Ruan Guangping,Liu Jufen,Wang Jinxiang,He Jie,Yang Jianyong,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To investigate whether the extract from chicken ovalbumin has the promotion effect on themesenchymal stem cell proliferation.Methods C57mouse bonemarrowmesenchymal stem cellswere isolated and cultured.Cell proliferation assay kitwas used to detect the effects of culturemedium,PBS,HBSS,and chicken ovalbumin extractwith different final concentration and different culturing time on cell proliferation.Results Under the conditions of different final concentration and different culturing time,chicken ovalbumin extract had a greater effect on cell proliferation than the culturemedium,PBS,and HBSS.Conclusion Extract from chicken ovalbumin can promote the proliferation of C57mouse bonemarrowmesenchymal stem cells.

chicken ovalbumin extract;C57mouse;bonemarrow mesenchymal stem cell;proliferation

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0826-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.005

2015-03-26）

国家973计划项目（2012CB5181060）；国家自然科学基金(31172170)；昆明市创新团队建设项目(昆科字2012AR070008)

650032昆明，成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室

潘兴华,E-mail:xinghuapan@aliyun.com