响应面法对忍冬藤总黄酮提取工艺的优化

姜宁　刘晓鹏　张俊霞　胡绩伟　李力　蒋晓军　吴皓

摘要：试验考察了乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取温度4个因素对忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤总黄酮提取的影响，并采用Box-Behnken试验优化了忍冬藤总黄酮提取工艺。结果表明，4个因素能显著影响忍冬藤总黄酮的提取，并优化得出最佳提取工艺为乙醇体积分数91%、液固比42∶1（mL∶g）、80 ℃提取2.7 h，此时总黄酮提取率为5.22%，与理论值5.24%相差不大，表明该工艺可行。

关键词：忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤；总黄酮；提取；工艺优化

中图分类号：S567.1+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2459-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.041

忍冬藤为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥茎枝，分布广泛，忍冬藤与金银花为植物忍冬的不同药用部位，均收载于《中华人民共和国药典》（一部）[1]。忍冬藤味甘、性寒，具有清热解毒、通络之功效。用于温病发热，疮痈肿毒，热毒血痢，风湿热痹[1]。现代研究表明，忍冬藤具有抗菌作用、抗病毒作用、抗炎作用、保肝作用以及调节免疫等药理作用[2]。

忍冬藤含有多种化学成分，包括有机酸类、环烯醚萜苷类、黄酮类、挥发油类等成分。有机酸类主要有绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、棕榈酸、马钱子酸、原儿茶酸等[2]；黄酮类主要有木犀草素、槲皮素、芹菜素、忍冬苷等[3]；环烯醚萜苷类主要有马钱子苷、獐牙菜苷、当药苷等[4]；挥发油类主要有烷烃、酯类、酮醇苯类化合物[5]。2010年版中华人民共和国药典将绿原酸、马钱子苷作为忍冬藤质量控制的指标。

黄酮类化合物（Flavonoids）广泛存在于自然界中，泛指两个具有酚羟基的苯环（A环与B环）通过中间三碳环（C环）相互联结而成的具有C6-C3-C6结构的一系列化合物，是许多植物的生物活性成分。其具有广泛的生理活性，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化和增强免疫力等药理作用[6]。目前针对忍冬藤总黄酮的研究尚不多见。本研究通过考察乙醇体积分数、液固比、提取温度和提取时间等因素，采用响应面分析优化忍冬藤总黄酮的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

忍冬藤由南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供；无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。仪器有紫外可见光分光光度计、多功能粉碎机、离心机、恒温水浴锅等。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

1）乙醇体积分数。称取一定量的忍冬藤粉末，分别用50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇对材料进行浸提，液固比30∶1（mL∶g，下同），70 ℃水浴2 h，离心取上清液。测上清液中的总黄酮含量，试验重复3次并计算提取率。

2）液固比。称取一定量的忍冬藤粉末，分别按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1加入80%的乙醇， 70 ℃水浴2 h，然后将浸提液离心取上清测总黄酮含量，试验重复3次计算提取率。

3）温度。称取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1加入80%的乙醇，分别于40、50、60、70、80、90 ℃水浴2 h，然后将提取液离心取上清，测其中的总黄酮含量，试验重复3次并计算提取率。

4）提取时间。称取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1向忍冬藤粉末中加入80%乙醇，水浴温度为70 ℃，水浴时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，然后离心提取上清，进行总黄酮含量测定，试验重复3次并计算提取率。

1.2.2 标准曲线的制作 称取芦丁标准品0.038 g在120 ℃下干燥至恒重，用30%的乙醇溶解并定容至250 mL，摇匀即得浓度为0.152 mg/mL的标准液。分别吸取上述标准液0、1、2、4、6、8 mL，加入30%乙醇使总体积为12.5 mL，加入0.7 mL的5%亚硝酸钠摇匀，放置5 min，加入10%硝酸铝0.7 mL，摇匀，放置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠5 mL，再加30%乙醇至刻度25 mL，摇匀，放置15 min，测510 nm波长处的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。

1.2.3 Box-Behnken优化试验 根据单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken试验设计，以乙醇体积分数、液固比、提取温度和提取时间为自变量，总黄酮提取率为响应值优化忍冬藤总黄酮的提取工艺。试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1A为乙醇体积分数对忍冬藤总黄酮提取率的影响。由图1A可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率也显著增加，当乙醇体积分数增至90%后，黄酮的提取率升高不再显著。图1B为液固比对忍冬藤总黄酮提取率的影响，由图1B可知，液固比较小（<20∶1）时，增加提取液的体积，对总黄酮提取率影响不显著，当液固比从20∶1增至40∶1时，总黄酮提取率上升极显著，但当液固比进一步增大时，总黄酮提取率差异不显著。图1C为提取温度对忍冬藤总黄酮提取率的影响，由图1C可知，温度较低时，提高温度对总黄酮的提取率影响较小，但也达显著水平，随着温度的不断升高，总黄酮提取率极显著上升，升至80 ℃后，温度对忍冬藤总黄酮的影响就不再显著。图1D为提取时间对忍冬藤总黄酮提取率的影响，由图1D可知，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率也显著升高，但当提取时间超过2.5 h后，时间对忍冬藤总黄酮的影响就不再显著。

2.2 Box-Behnken试验结果

2.2.1 回归方程的建立 Box-Behnken试验优化忍冬藤总黄酮提取工艺的结果见表2。经统计软件Design-Expert 8.0分析，建立了如下四元二次回归方程：

R=5.07+0.34A+0.35B+0.28C+0.49D+0.24AB- 0.12AC-0.36AD-0.29BC-0.39BD-0.44CD-0.63A2- 0.56B2-0.26C2-0.39D2

方差分析结果见表3。由表3可知，该模型达极显著水平，失拟项不显著，说明此模型与实际情况拟合得很好。根据建立的回归模型，计算得出当乙醇体积分数为91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h时，总黄酮的提取率最高，理论值为5.24%，按优化的工艺条件提取忍冬藤总黄酮，提取率为5.22%，与理论值相差不大，说明该工艺有较强的实用价值。

2.2.2 响应面分析 为了探究各因素之间的交互作用，对Box-Behnken试验结果进行了响应面分析（图2）。由图2可以看出，当提取温度和提取时间固定时，随着乙醇体积分数和液固比的升高，总黄酮提取率也显著上升，到达最高值时，又随着乙醇体积分数和液固比的上升，提取率显著下降（图2a）；当液固比和提取温度固定时，乙醇体积分数和提取时间处于较低水平时，总黄酮提取率也较低，乙醇体积分数和提取时间的增加会使总黄酮的提取率增加，但提取率达到最大值后，又随着乙醇体积分数和提取时间的升高总黄酮提取率逐步下降（图2b）；当固定液固比和提取时间时，乙醇体积分数和提取温度处于低水平时，总黄酮的提取率也很低，随着乙醇体积分数和提取温度的增加，总黄酮提取率随之上升，达到最大值之后，乙醇体积分数和提取温度的进一步增加总黄酮提取率反而呈下降趋势（图2c）；图2d结果表明，液固比和提取时间的交互作用对总黄酮提取率影响显著，液固比和提取时间处于低水平或高水平时，忍冬藤总黄酮的提取率较低；而液固比和提取温度的交互作用对总黄酮提取率的影响与乙醇体积分数和提取温度的交互作用相似（图2e）；当固定乙醇体积分数和液固比时，随着提取温度与提取时间的增加，总黄酮提取率也增加，当提取时间和提取温度进一步增加时，提取率反而下降（图2f）。

3 小结与讨论

本研究对影响忍冬藤总黄酮提取的4个因素进行单因素试验，并根据单因素试验的结果确定Box-Behnken的因素和水平，得到最优工艺是乙醇体积分数为91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h，这是因为忍冬藤总黄酮在高浓度的乙醇溶液中溶解性较好；液固比增大有利于提高总黄酮细胞内外的浓度差从而加大溶出速度，但液固比过大，会造成试剂的浪费和加大提取过程中的损耗；高温使总黄酮溶出速度加快，但温度过高会使物质不稳定；适当的增加提取时间，会使总黄酮的溶出量增加，但当细胞内外总黄酮浓度趋于平衡后，溶出不再增加。当然，乙醇是否是最佳溶剂还有待进一步研究。

参考文献

[1] 中国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 鲁思爱.忍冬藤的化学成分及其药理应用研究进展[J].临沂大学学报，2012，34（3）：132-134.

[3] 张 聪，殷志琦，叶文才，等.忍冬藤的化学成分研究[J].中国中药杂志，2009，34（23）：3051-3053.

[4] 马 荣，殷志琦，张 聪，等.忍冬藤正丁醇萃取部位的化学成分[J].中国药科大学学报，2010，41（4）：333-336.

[5] 王书妍，翁 慧，张 力，等.忍冬藤挥发油化学成分GC/MS分析[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2011，26（1）：18-20.

[6] 程秋月，郭 菁，张成义.黄酮类化合物药理作用的研究[J].北华大学学报（自然科学版），2011，12（2）：180-183.