响应面法对三七总皂苷超高压提取工艺的优化

韩建军 宁娜 郁建生

摘要：为了优化超高压提取三七（Panax notoginseng）总皂苷的提取工艺，利用Box-Benhnken 中心组合设计原理和响应面分析法，在单因素基础上，以三七总皂苷提取率为响应值，选取乙醇体积分数、提取压力、料液比和提取时间4个因素，研究各因素及其交互作用对总皂苷提取率的影响。结果表明，优化的提取条件为乙醇体积分数71%、提取压力403 MPa、料液比1∶71（g∶mL）、提取时间5 min。在此条件下三七总皂苷实际提取率为11.82%，与理论预测值（11.91%）的相对误差仅为0.76%。

关键词：三七（Panax notoginseng）；总皂苷；响应面法；超高压

中图分类号：R284.2；S567.23+6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2455-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.040

中药三七为五加科人参属植物三七（Panax notoginseng）的干燥根，具有活血化瘀、消肿止痛、止血等功效，为中国传统名贵中药材[1]。三七含有皂苷类、挥发油、黄酮类等多种成分[2]。其中，2010版《中华人民共和国药典》[3]将总皂苷类成分作为三七药材的质量指标，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1。在临床上，三七总皂苷用于心血管疾病的治疗[4，5]。目前已报道的三七总皂苷的提取方法有渗漉法、浸渍法、回流法、微波法[6]等，但这些方法不同程度地存在提取时间长、效率低，且由于长时间加热会造成皂苷活性的降低、损失等问题。超高压提取技术是在常温条件下提取植物中有效成分的新技术。与传统提取技术相比，超高压提取技术可以缩短提取时间、降低能耗、减少杂质成分溶出的同时，提高有效成分的得率，而且超高压提取是在常温下进行的，避免了活性成分的受热分解[7，8]。

目前中药提取工艺优化过程中，数理统计常用正交设计或均匀设计进行拟合，虽然试验次数少，但精密度不够，对于非线性拟合的模型不适合。而Box-Behnken试验设计属于效应面法的一种设计，可在因素与响应值之间建立数学模型，通过对数学模型的处理得出多变量间的相互关系与影响因素。本试验以三七总皂苷提取率为指标，采用超高压提取技术，结合单因素试验和Box-Behnken设计对三七总皂苷的提取工艺进行优化[9，10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 三七药材购于贵州省铜仁市药材市场，经铜仁职业技术学院梁玉勇教授鉴定为五加科人参属植物三七的根，经干燥后粉碎过60目筛，备用；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1标准品均购于中国药品生物制品鉴定所（批号分别为：110745-201318、110703-201128和110704-201424）；乙腈（美国Tedia公司）为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为去离子水。

1.1.2 仪器与设备 美国安捷伦公司Agilent-1200LC高效液相色谱系统（包括G1311A四元梯度泵、G1313A标准型自动进样器、G1316A柱温箱、G1314A紫外检测器、Agilent Chemstation 色谱工作站）；UHP 900×2-Z超高压处理装置（包头超高压仪器厂）；Sartorius BP 211D型电子天平（德国赛多利斯股份公司）；UV-2012PCS型紫外可见光分光光度计（尤尼柯上海有限公司）；SK5200HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为DIKMA Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）与水（B），线性梯度洗脱程序见表1；流速：1.0 mL/min； 检查波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按三七皂苷峰计算应不低于4 000。

1.2.2 标准溶液的制备 精密称取三七皂苷R1 10.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得三七皂苷R1贮备液（1.04 mg/mL）。精密称取人参皂苷Rg1 10.1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得人参皂苷Rg1贮备液（1.01 mg/mL）。精密称取人参皂苷Rb1 10.2 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得人参皂苷Rb1贮备液（1.02 mg/mL）。精密吸取1 mL 三七皂苷R1贮备液、4 mL人参皂苷Rg1贮备液、4 mL人参皂苷Rb1贮备液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.104、0.404、0.408 mg/mL的R1、Rg1、Rb1三七标准混合溶液。

1.2.3 供试品溶液的制作 精密称取药材粉末适量，按照料液比1∶40（g∶mL，下同）加入三氯甲烷，回流提取3 h，过滤除去滤液，滤渣挥干溶剂后即得脱脂样品。精密称取4.0 g三七脱脂样品，按响应面设计的工艺进行超高压提取。提取液经过滤、离心后，减压回收乙醇，冷冻干燥，得到三七醇提物浸膏。精密称取各組浸膏0.5 g，加甲醇溶于100 mL容量瓶中，定容、离心，取上清液，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。三七总皂苷提取率=（浸膏中总皂苷含量/药材质量）×100%，其中，总皂苷包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1。

1.2.4 标准曲线的制备 精密吸取混合标准溶液2、4、8、12、16、20 μL分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件来测定，测定3个皂苷成分的吸收峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），吸收峰面积为纵坐标（A）进行线性回归，求回归方程，并测定该试验的精密度、重复性、稳定性、加样回收率等指标。

1.3 单因素试验

1.3.1 乙醇体积分数 设定提取压力400 MPa，料液比1∶60，提取时间4 min，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇进行超高压提取。

1.3.2 提取压力 以70%乙醇为提取溶剂，设定料液比1∶60，提取时间4 min，分别在100、200、300、400、500 MPa下进行超高压提取。

1.3.3 料液比 以70%乙醇为提取溶剂，设定提取压力400 MPa，提取时间4 min，分别按1∶20、 1∶40、1∶60、1∶80、1∶100的料液比进行超高压提取。

1.3.4 提取时间 以70%乙醇为提取溶剂，设定提取压力400 MPa，料液比1∶60，分别超高压提取1、2、3、4、5 min。

1.4 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据响应面Box-Behnken设计原理，选取乙醇体积分数（X1）、提取压力（X2）、料液比（X3）和提取时间（X4）4个因素为自变量，以三七总皂苷提取率为响应值，进行4因素3水平的响应面分析，因素与水平见表2。

2 结果与分析

2.1 三七HPLC图及方法学评价结果

由图1可知，在“1.2.1”色谱条件下，三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1成分达到较好的分离效果。线性回归方程分别为：A=507.45X-34.16，r=0.999 8；A=587.75X+94.40，r=0.999 9；A=567.03X+72.62，r=0.999 9。结果表明，三七皂苷R1含量在0.208～2.080 μg、人参皂苷Rg1含量在0.808～8.080 μg、人参皂苷Rb1含量在0.816～8.160 μg与峰面积呈良好的线性关系。精密度试验中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD分别为1.02%、1.07%和0.97%，说明仪器精密度良好。重复性试验中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD分别为0.52%、0.47%和0.57%，说明方法的重复性良好。稳定性试验中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD分别为0.87%、0.71%和0.67%，说明在24 h内稳定性良好。加样回收试验中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的平均加样回收率分别为100.3%、100.1%和99.8%，RSD分别为0.43%、0.55%和0.49%。上述结果表明，该HPLC法适于三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的含量测定。

2.2 单因素试验结果

各因素对总皂苷提取率的影响见图2。由图2A可知，随着乙醇体积分数的增大，三七总皂苷提取率增大，但当乙醇体积分数超过70%，组织细胞渗透性下降，引起总皂苷溶出量降低，因此最佳乙醇体积分数为70%。由图2B可知，在100～400 MPa，三七皂苷提取率随着提取压力的增加而增加，当提取压力超过400 MPa后，提取率有所下降，可能与提取压力过大引起其他杂质成分溶出有关。由图2C可知，在1∶20～1∶60，总皂苷提取率随着提取溶剂用量增加而增加，当料液比低于1∶60时，皂苷的溶出量增加缓慢。从提取效果和溶剂用量等方面考虑，最佳料液比为1∶60。由图2D可知，1～4 min内皂苷提取率随着提取时间的增加而增加，时间超过4 min后，提取率增加略有下降，可能随着提取时间延长，其他杂质溶出导致溶液总溶质溶度增加，引起皂苷的溶出传质阻力增加，提取率反而下降。因此最佳提取时间为4 min。

2.3 响应面优化结果

2.3.1 二次响应面回归模型的建立与分析 试验设计及结果见表3。采用Design Expert 8.0.6统计软件对表3数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程：Y=-127.488 33+1.992 83X1+0.081 367X2+0.226 58X3+18.586 67X4-2.025 00×10-4X1X2-1.925 00 ×10-3 X1X3-0.072 000X1X4+1.350 00×10-4X2X3-2.825 00×10-3X2X4+4.750 00×10-3X3X4-0.010 179 X12-7.816 67×10-5X22-1.197 92×10-3X32-1.307 92 X42。对该模型进行显著性检验，方差分析结果见表4。由表4可知，模型极显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.188 07>0.05），其R2=0.919 9，校正R2=0.839 7，说明模型对试验拟合较好。回归方程各项分析表明，该回归模型的一次项中X3和X4极显著影响三七总皂苷提取率；二次项中X12、X22、X32、X42均极显著影响三七总皂苷提取率；交互项中X1X4极显著影响三七总皂苷提取率。根据F大小可判断，各个单因素对总皂苷提取率影响作用依次为：X3>X4>X2>X1。

2.3.2 两因子间交互作用分析 由各因素对响应值构成的三维空间曲面图可直观反映各因素间交互作用对响应值的影响。观察曲面的倾斜度可以确定两因素交互作用对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著。由图3可知，在所选范围内存在极值，即响应面的最高点。通过对比曲面倾斜度可知乙醇体积分数与提取时间的交互作用对总皂苷提取率影响较显著，这与方差分析结果一致。通过回归模型的预测，得到超高压提取三七总皂苷的最佳工艺为乙醇体积分数70.97%、提取压力402.89 MPa、料液比1∶70.74、提取时间4.87 min，在此条件下三七总皂苷理论提取率为11.91%。考虑到试验的可操作性，最佳工艺条件修正为乙醇体积分数71%、提取压力403 MPa、料液比1∶71、提取时间5 min。在此条件下进行5次平行试验进行验证，三七总皂苷平均提取率为11.82%，与理论预测值的相对误差仅为0.76%，证明了该模型的有效性

3 小结

本试验采用超高压工艺提取三七总皂苷，该方法时间短、耗能低，且提取是在常温下进行，避免了高温对活性成分的影响。优化所得的最佳工艺条件为乙醇体积分数71%、提取压力403 MPa、料液比1∶71、提取时间5 min，该优化条件下的总皂苷的提取率为11.82%。

参考文献：

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