超高液相色谱法测定三七中三七总皂苷的方法研究

邓传江+高铁燕+杨勇+孙楠+洪梅+余垒柱

[摘 要]目的：建立用超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3与三七皂苷R1的方法，以进一步探讨超高效液相色谱法用于控制三七质量的可行性。方法：色谱柱为UPLC BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相为A相（乙腈）-B相（水溶液），梯度洗脱程序为：

0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速为0.4 ml/min；检测波长为203nm。结果：本法专属性强、灵敏度高、准确性好，四种皂苷的线性范围宽，R值均大于0.999，方法学总回收率为99.88% ，RSD为0.44%（n=3）。结论：方法简便，快速，准确，重现性好，可用于三七药材中三七总皂苷的含量测定。

[关键词]超高效液相色谱法；三七；人参皂苷Rg1 、Rb1、Rb3；三七皂苷R1

中图分类号：TS580 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）25-0113-02

[Abstract]OBJECTIVE To determine total notoginseng glycosides in notoginseng by UPLC for quality contro1， further explore the quality control of notoginseng by ultra-high performance liquid chromatography. METHODS An UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm，1.7μm） column was used with a mobile phase consisted of phase A（Acetonitrile）-phase B （Secondary ultrapure water） in gradient elution 0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）by flow rate of 0.4mL·min-1 in this method，and UV detector was set at 203nm. RESULTS The linear range of three glycosides were all wide（r>0.999）.The range of recovery of total notoginseng glycosides in notoginseng was 99.88% （RSD=0.44%）（n=3）.CONCLUSIONS The method developed is rate，simple，rapid and reproducible，Which can be applied for the quality control of notoginseng tablets.

[Key words]UPLC； notoginseng； ginsenosidesRg1， Rb1， Rb3； notoginsenoside R1。

三七是云南道地特产中药材，来源于五加科人参属植物Panax notoginseng-（Burk. ） F. H. Chen 的干燥根，有散瘀止血，消肿定痛之功效。用于咯血，吐血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌打肿痛等，主产于云南省文山州。三七主要含有皂苷、多糖、氨基酸等多种化学成分。三七总皂苷含有人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 和三七皂苷R1，R2，R3，R4，R6 等20 余种皂苷成分。其中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1，是三七总皂苷中含量最高的两个成分，而三七皂苷R1则是三七总皂苷的特征化合物，但含量较低。三七总皂苷的测定方法主要有：HPLC法、比色法、薄层扫描法等。但目前采用超高液相测定三七中的三七总皂苷的方法尚未报道。本文重点就采用超高液相测定三七总皂苷的检测和分析方法进行全面的综述。

1 仪器与试剂

Waters Acquity型超高效液相色谱仪（配置：紫外检测器、带脱气四元泵、自动进样器）。色谱纯乙腈，色谱纯甲醇，超纯水（自制）。三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3对照品（北京上立方联合化工技术研究院），三七粉、三七主根粉、三七花粉、三七剪口粉、三七茎叶粉（自购）。

2 实验方法

2.1 色谱分析条件：ACQUITY UPLC BEH Cl8 1.7μm（2.1×50 mm）；流动相：A相（乙腈）一B相（水溶液），梯度洗脱程序为：0min（20：80） -0.4min（30：70）- 1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速为0.4 ml/min；检测波长为203nm；进样量：4μL，外标法定量。

2.2 测定方法

2.2.1 对照品混合溶液的制备 分别精密称取对照品人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/mL 的对照品混合储备液；精密吸取2.0mL置100 mL容量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液稀释至刻度，摇匀，制成对照品混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 三七除去泥土洗净后，晾干，粉碎，过100目筛.取细粉。精密称取本品细粉（三七粉、三七主根粉、三七剪口粉约2g，三七花粉约4g、三七茎叶粉约8g）置50 ml 具塞离心管中，加入甲醇15mL，密塞，摇匀，超声30 min后；置于离心机上10000ran/min离心30min。上清液置于50.0 ml比色管中。按上述操作重复超声、离心两次后，用甲醇定容，摇匀，取样液，经O.2μm 滤头过滤，取滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 测定方法 分别取对照品混合溶液及供试品溶液于样品瓶中经自动进样器吸取4μL样液注入超高液相色谱仪，记录色谱图，以对照品混合溶液色谱图中三七皂苷R1 、人参皂苷Rg1 、Rb1、Rb3 的峰面积外标法计算三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3的含量。

2.3 稳定性试验 日内精密度取同一批供试样品，在同一天时间里，分别于2、4、6、8、10、24h进行含量测定，计算三七总皂苷含量，进行精密度分析，结果显示平均含量为100.57%，RSD为1.26%。表明该方法测定含量日内精密度良好。中间精密度取供试样品，在连续5d时间里，分别每天取样进行含量测定，计算三七总皂苷含量，进行精密度分析，结果显示平均含量为100.8% ，RSD为1.35%。表明该方法测定含量精密度良好。

2.4 线性关系考察 分别精密称取对照品人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/mL 的对照品溶液。用移液器分别吸取上述对照品溶液10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μL加甲醇-水（70：30）溶液稀释至1.0mL，摇匀；制成人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号系列浓度溶液；分别取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号溶液于样品瓶中经自动进样器吸取4μL样液注入超液相色谱仪测定；记录峰面积，并以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性回归，结果见表l。

2.5 回收率试验 精密称取已知含量的样品，精密加入三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Rbl、Rb3对照品各2mg，按照“2.2.2”供试品溶液的制备方法进行处理得供试品溶液，测定每份样品的含量，分别计算回收率，结果见表2。

2.6 重复性试验 取同一批次样品共6份按照供试品溶液的制备方法制备三七样品溶液，上机测定并分别计算人参皂苷及三七皂苷的含量，结果显示人参皂苷Rg1、Rb1、Rb3和三七皂苷R1含量的RSD分别为0.84%、0.92%、0.87%、0.58% ，三七中各皂苷峰面积积分值变化不大。表明该方法测定含量重现性良好。

3 结果与讨论

3.1 结果 通过对三七中4种主要有效成分三七皂苷Rl以及人参皂苷Rg1、Rbl、Rb3含量的测定，发现不同规格的三七上述4种皂苷的含量相差较大，相同规格三七的不同部位上述4种皂苷的含量也存在差异，采用超高效液相色谱法同时测定上述4种皂苷的含量，分离效能高、重现性好、精密度良好、结果准确可靠、分析时间短。

3.2 讨论 本文对提取方法进行了优化选择并与GB/T 19086-2008《地理标志产品 文山三七》中的提取方法进行比较，结果表明本实验采用的方法，操作过程中三七样液的三七总皂苷损失更少；同时本实验采用梯度洗脱，整个分析过程在2min内完成，进样间隔2-3min即可达到平衡，大大的缩短了检测分析时间。

4 结论

本文所建立的梯度洗脱超高液相色谱法，分离效能高、重现性好、精密度良好、结果准确可靠、分析时间短为检测三七及其三七制品中的三七总皂苷的含量提供了一定的依据和参考。

参考文献：

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