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牛乳溶菌酶的安全性评价

2015-08-06张璐莹罗春海许启有李诗莹邹晓付世新

黑龙江八一农垦大学学报 2015年1期
关键词:溶菌酶牛乳链球菌

张璐莹,罗春海,许启有,李诗莹,邹晓,付世新

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319)

子宫内膜炎是奶牛主要疾病之一,对畜牧经济有着直接的经济影响。子宫内膜炎主要发生的原因为细菌感染[1],而目前临床治疗仍旧以抗生素为主要治疗方法,伴随着耐药性和药物残留问题的日益凸显,临床治疗上需要可以替代抗生素的新型药物[2]。溶菌酶作为一种绿色药物[3],受到了人们的关注,其具有杀菌效果强、菌谱广、稳定性好等优点[4-5]。以此为基础,实验室通过毕赤酵母表达系统制备了重组牛乳溶菌酶,并对其纯化浓缩后获得重组牛乳溶菌酶粉剂,不仅具有以上的生物学作用,同时具有同源性的优势。实验主要通过对牛乳溶菌酶进行溶血试验和刺激性试验,进行安全性评价,为进一步临床试验提供保障和依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康白兔家兔6 只,体重2.0~2.5 kg。

1.2 溶菌酶

实验室制备的重组牛乳溶菌酶粉剂。

1.3 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌由黑龙江八一农垦大学诊断实验室提供。

2 方法

2.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的确定

2.1.1 牛乳溶菌酶溶液和菌液的制备

取实验室已获得的纯化浓缩后的重组牛乳溶菌酶粉剂,用蒸馏水配制成浓度为10.0 mg·mL-1的牛乳溶菌酶溶液[6]。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌在营养琼脂平板上划线分离培养,挑取少量单个菌落加入肉汤培养基中,37 ℃恒温箱培养 24 h,分别制成肉汤培养基。

2.1.2 牛乳溶菌酶抑菌效果的测定

取15 只试管于试管架上,分别加入已制成的含菌肉汤培养基1 mL。在1 号试管中加入1 mL 牛乳溶菌酶溶液,之后倍比稀释,最后一支试管不加。再分别加入100 μL 金黄色葡萄球菌菌液,混匀。大肠杆菌、无乳链球菌同样操作,37 ℃恒温箱培养24 h,观察并记录结果。

2.2 牛乳溶菌酶溶血性试验

2.2.1 2%兔红细胞混悬液的配制

健康家兔心脏取血20 mL,于带有玻璃珠的锥形瓶中,振荡摇晃10 min。将除去纤维蛋白原的血液转移到离心管内,加入10 mL 生理盐水,混匀,2 500 r·min-1离心5 min。弃上清后加入生理盐水,混匀后继续离心。重复步骤,用生理盐水洗涤3 次,至上清不为红色为止。取管底2 mL 红细胞液,与98 mL 生理盐水配制成2%的兔红细胞混悬液。

2.2.2 溶血试验

在试管架上排列7 支试管并标号,将牛乳溶菌酶溶液、生理盐水、2%兔红细胞混悬液和蒸馏水按表1 加入试管中。其中,6 号试管不加牛乳溶菌酶溶液作为空白对照,7 号试管只加2%兔红细胞混悬液和蒸馏水作为阳性对照。将1~6 号试管置于37 ℃恒温箱中,分别在1 h、2 h、3 h 时观察并记录溶液变化情况[7]。

表1 溶血试验各溶液加样值Table 1 Sample solution of Hemolysis test

2.3 牛乳溶菌酶刺激性试验

选取正常健康白色家兔6 只,排除眼角膜、虹膜和结膜有病变和炎症变化的,试验进行自身对照。试验时在右眼滴加0.1 mL 生理盐水,左眼滴加0.1 mL的牛乳溶菌酶溶液,然后使兔子闭合眼睛10 s 左右。在滴眼后2、6、12、24、48、72 h 对家兔左右眼进行检查,根据表2 进行眼刺激反应评分[8],并按照表3 进行眼刺激强度评价。

表2 眼刺激反应评分标准Table 2 Score standard of eye irritative action

表2 眼刺激反应评分标准Continued table 2 Score standard of eye irritative action

表3 眼刺激评价标准Table 3 Level standard of eye irritative action

3 结果

3.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的确定结果

抑菌试验结果,牛乳溶菌酶对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显,大肠杆菌、无乳链球菌的抑菌效果相对较弱。金黄色葡萄球菌从13 号试管开始出现浑浊,表明其中有细菌生长,大肠杆菌和无乳链球菌分别从3 号和6 号开始出现细菌生长现象,具体抑菌结果见表4。

表4 牛乳溶菌酶抑菌试验结果Table 4 Results of LYZ-1 bacteriostatic test

3.2 牛乳溶菌酶溶血性试验结果

在3 个时间点中除7 号试管的阳性对照溶液呈澄明红色外,其余6 支试管内溶液均未呈澄明红色,上层液体为无色透明,红细胞全部下沉,振荡摇晃试管可见红细胞在溶液中均匀分散。溶血试验结果表明,牛乳溶菌酶溶液无溶血和凝集作用。试验结果见表5。

表5 溶血性试验结果Table 5 Results of hemolysis

3.3 牛乳溶菌酶刺激性试验结果

家兔左眼用药后,在6 h 后有轻度的眼角膜充血现象,12 h 出现少量分泌物,无水肿现象,随着时间的延后,刺激性逐渐减弱,24 h 后充血现象消失,但分泌物依然存在,48 h 后基本表现正常(见表6)。根据评分结果,牛乳溶菌酶对黏膜无刺激。

表6 牛乳溶菌酶刺激性试验结果Table 6 Results of eye irritetive action

4 讨论

牛乳溶菌酶作为一种新型的生物制剂,应用于临床治疗,不仅能够抑制细菌的生长,还能增强牛自身的免疫力[9],并且可以促进子宫内膜的恢复[10]。奶牛子宫内膜炎主要致病菌为大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌[11],牛乳溶菌酶对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果,对大肠杆菌等革兰氏阴性菌也有一定抑菌效果。根据药典2010 版,试验进行了动物安全性试验,为牛乳溶菌酶应用于临床提供保障。易明梅等讨论验证了溶菌酶基因药物应用于奶牛后,对乳汁、尿液以及其他分泌物、排泄物等进行检测,结果显示溶菌酶基因药物对环境同样是安全的。因此,初步完成了牛乳溶菌酶应用于临床前的安全性试验,其临床效果还有待临床试验时进一步探索和验证。

[1]王洪海,王国卿,郭梦尧,等.中药治疗奶牛子宫内膜炎研究进展[J].中国收益杂志,2010,46(8):64-65.

[2]孙蕾,常喆,王军.治疗奶牛子宫内膜炎复方制剂的安全性评价[J].黑龙江畜牧兽医,2011(5):128-129.

[3]Yu Q,Li J.Lysozyme and its applications[J].Academic Periodical of Farm Products Processing,2007,109:34-38.

[4]戴晏,朱建国,孙怀昌,等.重组溶菌酶基因工程质粒治疗奶牛乳房炎的效果分析[J].中国兽药杂志,2009,43(11):39-41.

[5]沈诚,林源,朱建国,等.重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ 治疗泌乳期奶牛乳房炎[J].中国奶牛,2011(4):4-6.

[6]郭醉元.溶菌酶与中药治疗奶牛子宫内膜炎的比较研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2008.

[7]邓元荣,卓仪荣,王玲.油茶皂苷的体外溶血试验研究[J].海峡药学,2008,20(12):29-32.

[8]郭世宁.防止奶牛子宫内膜炎新型复方药物制剂宫炎清的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2002.

[9]Supungul P,Rimphanichayakit V,Aoki T,et al.Molecular characterization and analysis of a ctype and two novel muramidasedeficient itype lysozymes form Penaeus monodon [J].Fish and Shellfish Immunol,2010,28(3):490-498.

[10]Callewaert L,Vanoirbeek KG,Luriquin I,et al.The Rcs two-component system regulates espression of lysozyme inhitors and is induced by exposure to lysozyme[J].J Bacteriol,2009,191(6):1979-1981.

[11]陈雪龙,罗春海,齐长学,等.大庆 地区奶牛子宫内膜炎致病菌的分离与鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报,2013,25(3):42-44.

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