间充质干细胞成骨分化过程中长链非编码RNA调控作用研究进展

赵培庆 王连庆 李 涛

山东省淄博市中心医院中心实验室，山东淄博255036

间充质干细胞成骨分化过程中长链非编码RNA调控作用研究进展

赵培庆 王连庆 李 涛

山东省淄博市中心医院中心实验室，山东淄博255036

间充质干细胞是一类具有自我更新与定向分化的干细胞，在组织修复与细胞生长发育中起重要作用。近期研究发现在间充质干细胞的发育过程中，部分长链非编码RNA表达上调与下调，表明它可能是间充质干细胞发育中的重要调控点，虽然目前该方面的功能性研究比较少，但其强大的研究潜力已经体现。

间充质干细胞；成骨分化；长链非编码RNA

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新与定向分化能力的细胞，1966首次发现时被冠以“成纤维祖细胞”之名，目前已经证实它可以分化成骨骼、软骨组织、脂肪组织及肌肉等组织，并且在组织修复及细胞生长调节中发挥重要作用［1-2］。研究发现，MSCs通过分泌前列腺素E2（PGE2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA）、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-11（IL-11）等细胞因子及生长因子来影响免疫微环境，对损伤的组织进行修复［3］。不同于胚胎干细胞，MSCs属于成体干细胞，因此不具有无限自我更新和永生化能力［4］。基于以上理论基础，因此其修复调控机制显得尤为重要。

1 lncRNAs的概念及在干细胞发育分化中的作用

长链非编码RNA（longnoncoding RNAs，lncRNAs）是一类转录长度大于200 bp的非编码RNA，有的甚至超过10 kb，可以形成复杂的空间结构，表明它们参与基因表达调控的分子机制可能更加复杂。根据它们在基因组中的位置可以分为lincRNA、天然反义链lncRNA和内含子区lncRNA［5］。目前已经证实它们在转录水平及转录后修饰水平进行调控，对基因表达调控、肿瘤诊断及阐述其分子机制方面越来越受到人们的重视。近期研究发现，lncRNAs在干细胞多能性及分化等方面起关键调控作用，Guttman等［6］通过转录测绘技术与染色质免疫共沉淀技术共发现40条与多能干细胞功能相关的lncRNAs，其中有20余条与多能标志物转录因子（Nanog，oct4）基因表达相关，表明其在胚胎干细胞分化过程中起重要调控作用。同时，Chakraborty等［7］也鉴定出3条与维持多能干细胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌细胞发育分化过程中，Wamstad等［8］也发现一条在其发育中起重要表观遗传调控作用的lncRNA。以上研究结果显示，lncRNAs在干细胞的生长发育及分化过程中起重要调控作用，研究其调控过程及发现新的长链非编码RNA势必为干细胞相关研究找到新的途径和方法。

2 间充质干细胞成骨分化过程中可能的最新调控策略

MSCs作为骨髓成骨细胞前体的重要来源，其分化增殖的时空特异性受到严格的调控。一般情况下，骨髓MSCs受遗传和表观遗传机制调控，但具体的分子机制有待阐明，MSCs向成骨细胞分化主要涉及以下几种信号传导通路：TGF6信号通路、MAPK通路、Runx/osteorix信号通路、Notch通路、Wnt通路等［9］。国外学者研究发现，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通过抑制通路中Runx2蛋白等关键分子的表达对MSCs向成骨分化起抑制作用［10-11］；相反，miR-2861、miR-148b等［12-13］可通过激活成骨通路中关键分子，对成骨作用起正向调控。这些MSCs成骨调控因子构成一个复杂的调控网络，对其成骨过程进行精细调节。已有研究证实lncRNAs可作为一种竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与其他RNA转录本竞争相同的microRNA，从而抑制microRNA对其靶基因的调控，但其在MSCs成骨作用中调控microRNA的具体机制目前还未见报道。Ye等［14］发现，组蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通过消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修饰对MSCs成骨分化进行调控，表明通过表观遗传学机制，KDM4B和KDM6B可作为治疗靶点来控制MSCs分化过程，可为骨质疏松症等骨代谢疾病治疗找到新的线索。近期，研究发现一种转化生长因子β途径抑制剂（smallmolecular SB431542）可快速诱导胚胎干细胞产生MSCs［15］，这一发现表明MSCs可通过大量生产应用于临床治疗与修复，但其中的具体调控分子机制目前还不是十分明确。体内炎症微环境对MSCs的调节也非常重要，微环境中的免疫细胞和炎症因子可以活化MSCs，诱导其免疫调节功能。最近Dang等［16］学者发现炎症因子诱导的自噬可以对MSCs免疫功能产生影响，该发现使MSCs的临床治疗产生新的期望。总之，阐明MSCs的调控机制可对临床治疗及其成骨分化调控产生重大影响，lncRNAs作为近期发现的基因“富矿”，虽然在调控MSCs方面报道较少，但它应该在其细胞分化调控中发挥重要作用。

3 lncRNAs对间充质干细胞的调控作用

近年来，随着高通量测序技术的普及，lncRNAs的重要功能逐渐受到重视，lncRNAs可通过影响基因表达、表观遗传学修饰、蛋白质活性调节等方式对生命活动进行调控。

在MSCs向软骨分化过程中，Wang等［17］发现有3638个lncRNAs有较大程度的变化（2166个表达上调及1472个下调），作者选择了两个表达上调的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9进一步分析验证，结果表明它们在诱导分化后的第28天仍然持续高表达，提示可能参与了MSCs向软骨分化的全过程。罗嘉全等［18］利用生物分析软件分析了在MSCs成骨过程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相关的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。发现大多数lncRNAs在MSCs成骨分化后其表达均较分化前下调，其中3个lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）变化有统计学意义。其可能的机制是通过正向调控Smurf1，促使Smurf1表达下调，进而减少Runx2的降解，最终促进MSCs的成骨过程。左长清等［19］用基因芯片技术发现了116个在MSCs成骨过程中差异表达的lncRNAs，细胞实验进一步证实lncRNA AK089560的表达值在C3H10T1/2细胞成骨分化的第2，4，6天明显下降，可能的机制是它参与维持MSCs处于未分化状态；进一步分析发现［20］，116个表达变化的lncRNAs中59个表达上调，57个则是表达下调；其中60.3%是基因间结构区域，另20.7%是位于编码区域；且24个lncRNAs都能找到相应的毗邻编码基因所匹配，提示它们可能是lncRNAs的调控目标基因。例如EGFR是成骨促进因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通过调控表皮生长因子受体信号通路来负向影响成骨过程；lncRNA NR_027652则通过影响DLK1、lincRNA0243通过影响IL-5参与了MSCs的成骨过程。程晨等［21］发现在MSCs成骨过程中表达明显下调的lncRNAs有24条，细胞实验进一步证实其中AK035085可能通过对成骨过程中关键基因抑制来起作用。Wang等［22］同样用芯片技术发现了一些在成骨分化过程中的重要lncRNAs，最终证实lncRNA H19和uc022axw.1的表达上调可能参与了MSCs成骨分化的过程。Zhu等［23］报道，lncRNA-ANCR可以维持成骨细胞的非分化状态，其分子机制主要是通过与EZH2作用来抑制Runx2蛋白的表达，从而导致成骨分化降低；相反，下调lncRNAANCR则可促进成骨分化。

MSCs在不同的解剖区域有不同的生物学活性，Dong等［24］据此通过芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表达差异情况，发现了457个表达上调及513个表达下调的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表达，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些则相比骨髓MSCs低表达，如NR 037182、NR 037595和XR 111050。作者还同时检测了相关的mRNA表达情况，并用生物信息学技术构建起一个lncRNAs-mRNA模型，分析发现，这些lncRNAs可能通过影响相关mRNA的转录水平进而影响了诸如凋亡、MAPK、Wnt等复杂的信号通路，最终影响到细胞的凋亡、增殖与分化过程，它们很可能也参与了MSCs的成骨分化进程。

有报道称MSCs细胞有致瘤倾向，Shoshani等［25］发现lncRNA H19高表达，则这种倾向更明显，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向调控作用，它也可以成为MSCs致瘤过程中的一个潜在治疗靶点；Liu等［26］的研究成果表明lncRNA HOTAIR也参与了表皮-间质的转化过程。在骨髓瘤细胞向MSCs转化过程中，lncRNA MALAT1可通过影响LTBP3基因表达参与了整个转化过程［27］。这些研究一定程度上拓展了人们对lncRNAs在MSCs生物学功能影响方面新的认识。

4 小结与展望

基因的经典功能是编码对细胞生命活动至关重要的蛋白质，但是占基因绝大部分的非蛋白编码序列则是由包括micro RNAs、lncRNAs等在内的调控序列组成。随着二代测序技术和生物信息学技术的不断成熟，大量的lncRNAs被发掘出来，初期的研究成果已经表明，lncRNAs参与了细胞分化、个体发育等重要生命活动的整个调控过程，并与人类的诸多重大疾病密切相关。DNA元件百科全书（encyclopedia ofDNA elements，ENCODE）计划已经在人类基因组中鉴定了9000余条lncRNAs，但其中具有明确生物学功能的仅有100条左右［28］，大量的基因“富矿”有待人类去开发。

相比其他细胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，虽然前期研究仅停留在生物芯片与生物信息学分析层面，其强大的研究潜力已经呈现出来。基于lncRNAs在生命领域的强大功能，随着新的研究技术体系的建立，lncRNAs在调控间充质干细胞分化、增殖、凋亡等重要生命活动中的确切分子机制最终将得以阐释。

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Progress on the regulate process of long non-coding RNA in osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cell

ZHAO Peiqing WANG Lianqing LITao
Department of Central Laboratory,Zibo Central Hospital,Shandong Province,Zibo 255036,China

Mesenchymal stem cell,one type of self-renewal and directed differentiation of stem cells,plays important roles in the tissue repair and cell growth.Recently,researchers have found thatmany long non-coding RNAs up and down regulated in the process ofmesenchymal stem cell development,which means it as an important regulatory point may plays important functions in the development ofmesenchymal stem cell.Although the researches are little focused on the functional studies,its potential prospect has been valued.

Mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Long non-coding RNA

R34

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0035-04

2015-03-31本文编辑：苏畅）

山东省自然科学基金（ZR2014HM042）。

赵培庆（1977.3-），男，硕士；研究方向：骨质疏松相关免疫机制。

李涛（1970.6-），男，博士，主任医师，硕士研究生导师；研究方向：骨质疏松与骨矿盐代谢。