响应面法优化超声波辅助提取蓝莓叶多酚

李颖畅,张明辉,马春颖,李作伟,李秀霞,张 笑

(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;3.辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

响应面法优化超声波辅助提取蓝莓叶多酚

李颖畅1,2,3,张明辉1,马春颖1,李作伟,李秀霞1,2,3,张 笑1,2,3

(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;3.辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”,辽宁锦州 121013)

以蓝莓叶粉末为材料,以超声波辅助乙醇提取蓝莓叶多酚,研究超声时间、超声功率、乙醇浓度、料液比对蓝莓叶多酚得率的影响,并采用响应面法优化了超声波辅助乙醇提取蓝莓叶多酚的工艺条件。结果表明:超声时间10 min,超声功率546 W,乙醇浓度64%,料液比1∶22(g/mL),蓝莓叶多酚得率为8.54%。超声波辅助提取法操作简便、得率高,是适合蓝莓叶多酚提取的一种工艺方法。

蓝莓叶多酚,超声波辅助法,提取工艺,响应面设计

蓝莓,又称乌饭树、越桔、蓝浆果等,属杜鹃花科越桔属植物[1]。我国蓝莓叶资源丰富,分布于全国各地。蓝莓叶,一般为椭圆形或者长圆形,全绿,药食两用。蓝莓叶中含有多糖、多酚类化合物、氨基酸、脂肪酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、有机酸、维生素、矿质元素、甾醇和萜类等[2-3]。多酚又名单宁、鞣质,是一类广泛存在于植物体内的次生代谢物质的混合物,是分子中具有多个羟基酚类植物成分的总称[4]。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、抗肿瘤和抗病毒等生物活性[5-9]。超声波提取技术是指利用频率高于20 kHz的声波通过超声波辐射压强产生的机械效应、空化效应和热效应加快物质的扩散溶解,有效提高化合物提取率[10]。超声波具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点,适合热敏物质的提取。目前对蓝莓的研究大多停留在蓝莓果多酚的提取、生物活性等研究上,对蓝莓叶多酚的研究还鲜有报道。本文采用超声波辅助乙醇提取蓝莓叶多酚,通过对蓝莓叶多酚提取工艺中超声时间、超声功率、乙醇浓度、料液比等因素与蓝莓叶多酚提取率关系的研究,结合响应面法对蓝莓叶多酚提取工艺进行优化,旨在探求蓝莓叶多酚提取的最佳工艺条件,为蓝莓叶多酚的深加工提供一定的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓叶(栽培品种“蓝丰”) 沈阳农业科学发展研究院;没食子酸标准品 中国药品生物制品检定所;Folin-Ciocalteu试剂 上海如吉生物科技发展有限公司;乙醇、无水碳酸钠,分析纯 天津市光复精细化工研究所。

万能高速粉碎机 欧凯莱芙(香港)实业公司;HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;UV-1600型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;FA2004型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司;Scientz-IID型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚含量的测定 多酚含量的测定采用福林酚比色法[11]。多酚吸光度和多酚浓度的回归曲线方程为y=0.0895x+0.0238(R2=0.9997),其中y是750 nm处多酚的吸光度,x是多酚浓度(mg/mL)。蓝莓叶多酚的吸光度在750 nm处测定,多酚浓度根据回归曲线方程计算,多酚得率根据以下公式计算。

多酚得率(%)=C×V×n×100/1000 m

其中:C是蓝莓叶多酚浓度(mg/mL),V是提取样品体积(mL),n是稀释倍数,m是蓝莓叶的质量(g)。

1.2.2 蓝莓叶多酚超声波辅助提取的单因素实验

1.2.2.1 超声时间对多酚得率的影响 称取2.00 g蓝莓叶粉末,在料液比1∶25(g/mL),乙醇浓度60%,超声波功率400 W的条件下,考察提取时间分别为4、6、8、10、12 min对蓝莓叶多酚得率的影响。

1.2.2.2 超声功率对多酚得率的影响 准确称取2.00 g蓝莓叶粉末,在超声时间8 min,乙醇浓度为60%,料液比1∶25(g/mL)条件下,考察超声功率分别为200、300、400、500、600 W对蓝莓叶多酚得率的影响。

1.2.2.3 乙醇浓度对多酚得率的影响 准确称取2.00 g蓝莓叶粉末,在超声时间为8 min,超声波功率400 W,料液比1∶25(g/mL)的条件下,考察乙醇浓度为20%、40%、60%、80%、100%对蓝莓叶多酚得率的影响。

1.2.2.4 料液比对多酚得率的影响 准确称取2.00 g蓝莓叶粉末,在超声时间为8 min,超声波功率为400 W,乙醇浓度为60%条件下,考察料液比为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55(g/mL)对蓝莓叶多酚得率的影响。

1.2.3 响应面实验 在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,设计4因素3水平的响应面法优化超声波辅助提取的工艺参数,实验因素与水平设计见表1。

1.3 统计分析

采用SAS 8.0 软件进行4因素3水平Box-Behnken实验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 超声时间对蓝莓叶多酚得率的影响

从图1可以看出,随超声时间的增加,蓝莓叶多酚得率提高。当超声时间为8 min时,多酚的得率达到最大值,为6.69%。超声时间为10、12 min多酚得率略有降低,但和超声时间8 min相比,多酚得率无显著性(p>0.05)差异。可能随超声时间的延长,超声产生的热量使提取液温度升高,多酚有少量降解所致。石珂心等[12]超声波辅助提取石榴籽多酚,超声时间为31 min,本文提取蓝莓叶多酚的超声时间比提取石榴籽多酚短很多,可能是因为提取蓝莓叶多酚的功率比石榴籽多酚的高,导致提取时间缩短,也可能是蓝莓叶多酚比石榴籽多酚容易提取。利用超声波提取多酚可大大节约提取时间,Porto等[13]发现用常规的浸提提取葡萄籽多酚时间为12 h,而用超声波提取只需15 min。从节约时间和成本考虑,选择提取蓝莓叶多酚的超声时间为8 min。

表1 蓝莓叶多酚提取Box-Behnken实验因素和水平

图1 超声时间对蓝莓叶多酚得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.2 超声功率对蓝莓叶多酚得率的影响

从图2可以看出,随超声功率提高,蓝莓叶多酚得率增加,这可能是由于超声波空化作用加快蓝莓叶细胞壁和细胞膜的破碎使蓝莓叶多酚更容易被提取。d’Alessandro等[14]报道超声波使植物样品组织能吸收更多的溶剂而膨胀,使细胞壁孔隙增大。在超声功率为500 W时,多酚得率达到最大值,之后超声功率再提高,多酚得率略有降低。功率为600 W与500 W相比,多酚得率无显著性(p>0.05)差异,说明当超声功率达到一定程度,产生的热量,导致部分多酚氧化损失,此时继续增加超声功率,蓝莓叶多酚得率无显著增加,选择超声功率为500 W。

图2 超声功率对蓝莓叶多酚得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.3 乙醇浓度对蓝莓叶多酚得率的影响

从图3可以看出,随乙醇浓度的提高,多酚得率呈现先升高后降低的趋势。乙醇浓度为60%时,多酚的得率为6.69%;乙醇浓度为80%时,多酚的得率为4.66%;而乙醇的浓度为100%时,多酚的得率只有1.75%。这可能是因为乙醇浓度低时随着乙醇浓度的增加,多酚类物质在乙醇溶液中的溶解度增加,乙醇浓度超过60%后,溶剂与蓝莓叶多酚之间的极性差距增大,导致多酚类物质的溶解度下降。最佳乙醇浓度为60%。

图3 乙醇浓度对蓝莓叶多酚得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration onthe extractionyield of polyphenols from blueberry leaves

2.4 料液比对蓝莓叶多酚得率的影响

从图4可以看出,随着料液比的增加,多酚得率也随之增加,当料液比为1∶25(g/mL)时,多酚得率达到最高,再增加料液比多酚得率反而降低,这可能是因为溶剂过少,溶液容易达到饱和,有效成分难以提取完全,而溶剂过多,原料中的杂质也会溶出,使多酚得率降低,同时也会增加成本。因此,最佳料液比为1∶25(g/mL)。这与鲍建峰等[15]超声提取香榧假种皮中总多酚的料液比是一致的。

图4 料液比对蓝莓叶多酚得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.5 响应面优化实验

2.5.1 模型的建立及其显著性检验 采用SAS8.0软件对实验数据进行回归分析,Box-Behnken的4因素3水平实验共27个实验点,前面24个是析因点,自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点,后面3个为零点,为区域的中心点,用以估计实验误差,每次所得蓝莓叶多酚得率见表2,由Box-Behnken Design设计方案所得的实验结果见表3。运用SAS程序对响应值进行回归分析,经回归拟和后得到回归方程:Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42。对回归方程系数进行显著性检验,从表3可以看出,作用显著的是X2、X3、X4,极显著的是X1,X1X2、X2X4,X32。从F值可以看出,对于该模型来说,各因素对蓝莓叶多酚得率的影响排序为:超声时间(X1)>超声功率(X2)>乙醇浓度(X3)>料液比(X4)。

表2 提取蓝莓叶多酚Box-Behnken的实验设计与结果

表3 提取蓝莓叶多酚的方差分析

2.5.2 反应条件的优化及模型验证 从结果来看,仅X1X2、X2X4交互作用极显著,其响应曲面图为图5,图6。图5为超声功率和超声时间对蓝莓叶多酚得率的影响,超声功率和超声时间对蓝莓叶多酚得率的影响是显著的,但超声时间的等高线更加密集,说明超声时间比超声功率对蓝莓叶多酚得率的影响更显著。图6为超声功率和料液比对蓝莓叶多酚得率的影响,超声功率对蓝莓叶多酚得率影响更显著。

由SAS8.0软件分析得到响应面值最大时,X1、X2、X3、X4对应的编码值分别为0.99、0.92、0.40、-0.62,与之对应的蓝莓叶多酚超声波辅助提取法的最佳工艺条件为:超声时间9.89 min,超声功率546 W,乙醇浓度64%,料液比1∶21.9(g/mL),此时,蓝莓叶多酚的理论得率达到8.54%。

为检验响应面的可靠性,采用得到的最佳提取工艺条件进行蓝莓叶多酚超声提取的验证实验,同时考虑实际操作的局限性,将工艺参数修正为超声时间10 min,超声功率546 W,乙醇浓度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此修正条件下进行3次平行验证实验,实验测得的蓝莓叶多酚得率为8.42%,与理论预测值8.54%基本吻合,因此,采用响应面法优化得到的提取条件参数准确可靠,具有实用价值。

图5 超声时间和超声功率对多酚得率影响的响应面图Fig.5 Response surface showing the effects ofultrasound time and ultrasound power on extraction rate ofpolyphenols from blueberry leaves

图6 超声功率和料液对多酚得率影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface for the effects ofultrasound power and the ratio of material and liquid onextraction rate of polyphenols from blueberry leaves

3 结论

3.1 应用SAS8.0软件,采用Box-Behnken Design建立了超声时间X1、超声功率X2、乙醇浓度X3、料液比X4与蓝莓叶多酚得率之间数学模型为

Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42,回归分析表明,相关系数R2=0.90197,表明回归模型显著,拟合程度好,有实际应用意义;通过显著性检验,各因素对结果影响排序为:超声时间(X1)>超声功率(X2)>乙醇浓度(X3)>料液比(X4)。

3.2 通过单因素和响应面实验得到最佳超声波提取条件为:超声时间10 min,超声功率546 W,乙醇浓度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此条件下进行验证实验,得到蓝莓叶多酚得率为8.42%,该值与理论预测值8.54%基本吻合,说明响应面模型可预测理论得率并很好的应用于蓝莓叶多酚提取工艺条件的优化。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of polyphenols from blueberry leaves by response surface method

LI Ying-chang1,2,3,ZHANG Ming-hui1,MA Chun-ying1,LI Zuo-wei,LI Xiu-xia1,2,3,ZHANG Xiao1,2,3

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;3.Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Polyphenols from blueberry leaves were extracted by ethanol and ultrasonic-assisted. The effects of ultrasonic time,ultrasonic power,ethanol concentration and ratio of solid-liquid on the extraction were studied. Extraction process of polyphenols from blueberry leaves was optimized by response surface method. The conditions of ultrasonic extraction were optimized by single factor and response surface method:ultrasound time 10 min,ultrasound power 546 W,the concentration of ethanol 64%,the solid-liquid ratio 1∶22(g/mL),the total polyphenols extacted in this condition was 8.54%. The ultrasonic assisted extraction is simple and high of extraction rate,so it is a suitable process for the extraction of polyphenols from blueberry leaves.

polyphenols from blueberry leaves;ultrasound-assisted;extraction technology;response surface design

2014-11-05

李颖畅(1973-),女,博士,副教授,主要从事农、水产品贮藏加工与质量安全控制方面的研究，Liyingchangsy@sina.com。

国家自然基金(31201308)。

TS209

B

1002-0306(2015)15-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.040