人工养殖大鲵皮体外消化及其胶原蛋白提取和功能性质研究

袁 通,王锡昌,陈弘毅,王 蔚

(上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

人工养殖大鲵皮体外消化及其胶原蛋白提取和功能性质研究

袁 通,王锡昌*,陈弘毅,王 蔚

(上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

通过体外消化法测定大鲵皮体外消化率;使用Box-Behnken设计响应面实验,优化大鲵皮胶原蛋白提取工艺;并对胶原蛋白冻干样的功能性质进行研究。结果表明:经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理的大鲵皮,其体外消化率高达96.66%;以加酶量、超声时间和提取时间为三因素,胶原蛋白提取率为响应值,利用响应面设计优化大鲵皮胶原蛋白提取率,其最优化参数为加酶量1000 U/mL料液、提取时间33 h以及超声时间12 min,此条件下最优大鲵皮胶原蛋白提取率为71.94%,与模型预测值(73.32%)较一致;在20 ℃、相对湿度43%和81%条件下,大鲵皮胶原蛋白能长时间保留20%水分;大鲵皮胶原蛋白在0.4 g/100 mL浓度,溶液pH7以及溶液盐离子浓度为1.25 mol/L时有最佳起泡性;当溶液pH4,盐离子浓度为0.25 mol/L时鲵皮胶原蛋白有最佳乳化性。

大鲵，胶原蛋白,体外消化,响应面,功能性质

中国大鲵(Andriasdavidianus),俗称娃娃鱼,属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科[1],是世界上现存两栖类动物中最长寿的动物[2]。野生大鲵作为我国珍稀名贵特产,已被列为国家二级保护动物[3]。大鲵具有较高的科研价值,也是一种传统的名贵药用动物,具有滋阴补肾、补血行气的功效[4]。随着大鲵养殖技术的提高,人工养殖大鲵的数量逐年上升,至2010年,全国大鲵养殖和繁殖数量已经达到170多万尾[5],资源量的增加使得大鲵能够更好地成为食品与药品的原料被开发利用。

胶原蛋白具有支撑器官和保护机体的功能,也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质[6]。胶原蛋白的化学结构、来源、生物学意义及其在正常和病理组织中的分布情况等也逐渐被人们所认识[7]。胶原蛋白诸多的优良性质,使其越来越多地应用于医药、食品、高档化妆品、生物肥料等工业领域[8]。水产胶原蛋白因其独特的生理功能和理化特性而成为研究的热点。大鲵皮中胶原蛋白含量非常丰富,其胶原蛋白可能具有一些陆生动物胶原蛋白所没有的功能特性[9],本文从大鲵皮体外消化性质进行研究;进而对大鲵皮胶原蛋白进行提取,并优化提取工艺;之后以胃蛋白酶提取的大鲵皮胶原蛋白冻干品作为原料,进行胶原蛋白功能性质的研究,旨在为将来大鲵资源开发利用,大鲵皮胶原蛋白应用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6尾人工养殖大鲵于2011年 8月采自陕西省汉中市留坝县养殖场,体长为(80.00±8.66)cm,体质量为(3.57±0.09)kg,-80 ℃保存;胃蛋白酶(250 U/mg)、L-羟脯氨酸标准品 购自Sigma公司;胰蛋白酶(3000 U/g) 购自生工生物工程(上海)有限公司;鲁花牌花生油 购自农工商超市临港店;其他试剂均为分析纯。

UV2300紫外分光光度计 天美科学仪器;HPP108恒温恒湿培养箱 德国美墨尔特;XS205电子天平、FE20pH计 梅特勒-托利多;T25高速分散机,T10basic分散机 IKA;AUY220天平Shimadzu;SW22振荡水浴床 德国Julabo公司;J-26XP冷冻离心机 贝克曼库尔特。

1.2 大鲵皮消化性质分析方法

将解冻大鲵皮剪碎,以0.05 mol/L盐酸作为消化液,液料比60∶1(v∶w),添加胃蛋白酶,37 ℃振荡3 h;洗净后用磷酸缓冲液调节pH至6.8,加胰蛋白酶在37 ℃下振荡3 h,用凯氏定氮法测定残留物中蛋白质含量,并计算样品蛋白质消化率[10]。

1.3 大鲵胶原蛋白提取纯化方法

1.3.1 提取鲵皮胶原蛋白的原料皮经过解冻剪碎,用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡1 d去除非胶原蛋白,期间更换1次浸泡液,去离子水洗净;用10%异丙醇浸泡1d去除脂质,期间更换1次浸泡液,去离子水洗净;加入含胃蛋白酶的0.5 mol/L醋酸溶液,液料比为20∶1(v∶w),在15 ℃条件下进行提取[11]。并参照国标GB/T 9695.23-2008进行羟脯氨酸含量测定。酶解液中胶原蛋白得率(W,%)和提取率(X,%)换算公式如下公式所示:

式中:ω为酶解液中羟脯氨酸的质量;11.1为羟脯氨酸换算系数。

1.3.2 鲵皮胶原蛋白的纯化 将提取液用纱布粗滤,滤液经过14000 r/min离心35 min,上清液添加含0.5 mol/L醋酸的氯化钠溶液直到溶液盐离子浓度为0.9 mol/L,搅拌后静置12 h,溶液经过6000 r/min离心25 min,取沉淀用0.5 mol/L醋酸溶液溶解12 h,溶液再经过14000 r/min离心35 min,取上清液用14 ku的透析袋进行透析直到无氯离子检出,样品溶液进行冷冻干燥,得到冻干样(PSC)待用[8]。

1.4 响应面优化胶原蛋白提取工艺

1.4.1 单因素实验 以加酶量:200、400、600、800、1000 U/mL料液;提取时间:12、18、24、30、36 h;超声时间:0、10、20、30、40 min为单因素条件分别进行实验,其超声频率为40 kHz,超声功率为300 W。并通过羟脯氨酸标准曲线换算胶原蛋白提取率。

1.4.2 因素设计与编码水平

表1 三因素实验设计方案

1.5 大鲵胶原蛋白吸湿性分析

以43%和81%为实验相对湿度,20 ℃为实验环境温度,精确称量0.5 g冻干试样PSC及甘油(对照样)平铺于40 cm×25 mm的称量瓶中,放置于设置好相对湿度和温度的恒温恒湿培养箱中,每隔6 h进行一次称量,直至称量瓶恒重,则样品吸湿性按公式[12-13]进行计算:

式中:W0为试样初始质量(g);Wn为试样第n小时后的质量(g)

1.6 大鲵胶原蛋白保湿性分析

以43%和81%为实验相对湿度,20 ℃为实验环境温度,精确称量PSC配制0.2%样品溶液以及5%甘油溶液(对照样),平铺于40 mm×25 mm的称量瓶中,并放置于设置好相对湿度和温度的恒温恒湿培养箱中,每隔3 h进行一次称量,直至称量瓶恒重,则样品保湿性按公式[14-15]进行计算:

式中:W0为称取样品的质量(g);W1为试样和称量瓶的初始质量(g);Wn为试样和称量瓶第n小时的质量(g)。

1.7 大鲵胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性分析

配制蛋白溶液,置于高速剪切机中,以12000 r/min剪切1 min,记录停止时泡沫体积,并记录10 min后泡沫体积。取不同蛋白浓度于0.5 mol/L醋酸溶液中进行实验,在0.4%蛋白浓度下,取不同pH溶液进行实验;在pH7,0.4%蛋白浓度时取不同溶液盐离子(NaCl)浓度进行实验。起泡性(FA)和泡沫稳定性(FS)计算公式[16]如下:

公式中:V0为起始溶液体积;V1为1 min剪切后泡沫体积;V10为静置10 min后泡沫体积

1.8 大鲵胶原蛋白乳化性和乳化稳定性分析

精确称量冻干样品,配制0.2%(g/L)蛋白溶液。取12 mL蛋白溶液与4 mL花生油混合,用分散机在12000 r/min条件下分散1 min,迅速从底部量取50 μL溶液与5 mL质量分数为0.1%的SDS溶液混合,用紫外分光光度计在500 nm处测定其吸光值(以0.1%SDS溶液为空白),混合液静置10 min再次进行吸光值测定。分别在不同pH条件下进行实验;并在pH=8时取不同离子浓度(NaCl)进行实验。乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)计算公式[17]如下:

式中:C为样品浓度,g/L;Φ为乳化液中油相的比例,0.25;L为比色皿光径,1 cm;N为稀释倍数;A0为乳化液1 min的吸光值;A10为乳化液10 min后的吸光值。

2 结果与分析

2.1 大鲵皮体外消化结果分析

大鲵皮体外消化率如图1、图2所示:

图1 不同胃蛋白酶添加量对大鲵皮消化率的影响Fig.1 The digestibility of skin by different pepsin amount

图2 不同胰蛋白酶添加量对大鲵皮消化率的影响Fig.2 The digestibility of skin by different trypsin amount

由图1可知,当酶含量达到1400 U/g料液时,大鲵皮体外消化率达到较高值为79.57%,其后胃蛋白酶量的增加对消化率提升不大,可能因为大部分蛋白已经酶解消化,所以选取1400 U/g料液作为最适胃蛋白酶添加量;由图2可知,经过胰蛋白酶酶解处理的人工养殖大鲵鲵皮其体外消化率并没有随着消化液中胰蛋白酶含量的增加而增加,基本呈现一个平稳的状态,说明消化液中超过500 U/g料液添加量之后其胰蛋白酶的含量对大鲵鲵皮的体外消化率并没有显著的影响。所以取胰蛋白酶添加量为600 U/g料液作为最优添加量。

如表2所示,经过胃蛋白酶和胰蛋白酶联合作用对人工养殖大鲵鲵皮体外消化率为96.66%。

表2 大鲵皮体外消化率

2.2 单因素实验结果分析

由图3a可知,随着超声时间的增加鲵皮胶原蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势;由于大鲵皮皮质较厚结构紧密,所以经过10 min超声能够使得大鲵皮提取率有显著提升;由图3b可知,胃蛋白酶含量在200 U/mL到800 U/mL之间,随着胃蛋白酶含量的上升,提取率呈上升趋势。由图3c可知,大鲵皮胶原蛋白提取率在12 h到30 h之间随着时间的增加呈上升趋势,随时间的增加,胶原蛋白浓度提升,酶解液粘度不断增加,胃蛋白酶与原料之间的接触逐渐减少,而当提取时间超过30 h,提取率没有显著变化。

图3 超声时间、加酶量和提取时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time, enzyme amountand extraction time on extraction of collagen

2.3 响应面结果分析

2.3.1 实验结果及回归方程 实验设计方案结果如表3。

表3 实验设计方案及其结果

采用Design expert8软件进行响应面优化分析,得到提取率Y对超声时间X1、加酶量X2和提取时间X3的二次回归模型:

Y=70.69+0.71X1+3.71X2+1.81X3+2.16X1X2+1.08X1X3+0.19X2X3-8.60X12-1.92X22-1.99X32

对上述回归模型进行回归系数和方差分析的显著性实验,结果如表4所示。

由表4可以得出模型的p为0.0099<0.01,表明模型为极显著;失拟项为0.0695>0.05,说明模型失拟不显著,与实际拟合较好。方程R2为89.67%,该回归模型能表述响应值的变化,因此该模型能够对大鲵皮胶原蛋白提取率进行分析和预测。根据回归模型X1、X2、X3的系数估计值 分别为0.71、3.71和1.81可知,各因素对大鲵皮胶原蛋白提取率影响大小顺序依次为:X2>X3>X1,即加酶量>提取时间>超声时间。

表4 回归参数方差分析

2.3.2 最优工艺参数和验证实验 采用Design-Expert软件进行大鲵胶原蛋白提取率优化,最终得到模型最优化参数为加酶量1000 U/mL溶液、提取时间33.32 h、超声时间12.02 min,此时大鲵皮胶原蛋白模型预测提取率为73.32%。为了验证模型方程的可行性,同时兼顾实际操作的便利性,调整上述模型参数为加酶量1000 U/mL溶液、提取时间33h、超声时间12 min,重复3次进行验证实验,最后得到大鲵胶原蛋白平均提取率为71.94%,与模型预测值73.32%仅偏差1.38%,说明相应面法建立的模型能真实地描述工艺中各个参数,此模型能较好地利用于优化大鲵皮胶原蛋白提取工艺。

2.4 鲵皮胶原蛋白吸湿性结果分析

鲵皮胶原蛋白在相对湿度43%和81%时吸湿性结果如图4、图5所示。

图4 相对湿度为43%时的吸湿性Fig.4 The Moisture absorption in 43% relative humidity

图5 相对湿度为81%时的吸湿性Fig.5 The Moisture absorption in 81% relative humidity

如图4可知,在相对湿度为43%时,大鲵PSC吸湿性达到10%左右;图5为相对湿度为81%时,大鲵PSC吸湿性达到20%左右;大鲵PSC吸湿性低于甘油吸湿性,这是因为甘油分子上含有三个羟基,其分子相对亲水基团比例较高,所以有较好的吸湿性,而大鲵PSC是三螺旋结构,其暴露外部的亲水基团比例相对较少,所以吸湿能力要低于甘油。

2.5 鲵皮胶原蛋白保湿性结果分析

鲵皮胶原蛋白在相对湿度43%和81%时失水率结果如图6、图7所示。

图6 相对湿度为43%时的失水率Fig.6 The water lose rate in 43% relative humidity

图7 相对湿度为81%时的失水率Fig.7 The water lose rate in 81% relative humidity

由图6可知,随着时间的增加,大鲵PSC和甘油的保水性要明显优于水对照组,同时得出大鲵PSC保水性要优于甘油组,但差异不显著。由图7可知,随着环境中相对湿度的增加,大鲵PSC保湿性增强。由于胶原蛋白分子相对于甘油分子含有更多亲水基团,水溶液中胶原蛋白与水分子能形成更紧密的结构,所以大鲵PSC具有较好地保湿性,能较长时间保留20%的水分。

2.6 鲵皮胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性结果分析

2.6.1 蛋白含量对鲵皮胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响 由图8可知,大鲵PSC起泡性要优于相同浓度下明胶溶液。并且在蛋白浓度为0.4%时大鲵PSC有最优起泡性为200%。由图9可知,大鲵PSC虽然有较好起泡性但是其泡沫稳定性较差,在蛋白浓度越低时其泡沫稳定性越差,在0.4%蛋白浓度时有最优泡沫稳定性为20%。

图8 蛋白浓度对溶液起泡性的作用Fig.8 The effect of protein concentration on foaming ability

图9 蛋白浓度对溶液泡沫稳定性的作用Fig.9 The effect of protein concentration on foam stability

2.6.2 溶液pH对鲵皮胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响 由图10可知,大鲵PSC在pH7时有最优起泡性150%,随着pH上升,起泡性上升,但在pH5时有一个明显下降点,这是因为在pH5时大鲵PSC处在其等电点附近,导致蛋白溶液稳定性下降,从而使得蛋白溶液起泡性降低。相比于明胶,在较低pH(低于4)时大鲵PSC起泡性要低于明胶起泡性,而当pH>4时大鲵PSC起泡性明显高于明胶起泡性。但是从图11可以得出明胶泡沫稳定性要明显优于大鲵PSC。

图10 pH对溶液起泡性的作用Fig.10 The effect of pH on foaming ability

图11 pH对溶液泡沫稳定性的作用Fig.11 The effect of pH on foam stability

2.6.3 溶液盐离子含量对鲵皮胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响 由图12可知,氯化钠浓度小于0.5 mol/L时大鲵PSC起泡性要低于明胶溶液,但当氧化钠浓度大于0.5 mol/L时,大鲵PSC起泡性要高于明胶溶液,而当氯化钠浓度在1.25 mol/L时,大鲵PSC有最优起泡性为180%。由图13可知,大鲵PSC在不同离子浓度下泡沫稳定性都要低于明胶,并且在离子浓度为0.5、0.75 mol/L时最为显著。

图12 离子浓度对溶液起泡性的作用Fig.12 The effect of ion concentration value on foaming ability

图13 离子浓度对溶液泡沫稳定性的作用Fig.13 The effect of ion concentration on foam stability

2.7 鲵皮胶原蛋白乳化性和乳化稳定性结果分析

2.7.1 溶液pH对鲵皮胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 由图14可知,大鲵PSC在pH2时乳化性基本与明胶持平,当pH大于2而小于8时,明胶的乳化性要优于大鲵PSC,当pH>8时,大鲵PSC乳化性则优于明胶;而pH6附近大鲵PSC处在其等电点,其乳化性出现了最低点0.45 m2/g。由图15可知,大鲵PSC在pH2时有较高的乳化稳定性,但随着pH升高乳化稳定性迅速降低,而在pH≥6时,大鲵PSC乳化稳定性基本与明胶持平。

图14 pH对溶液乳化性的作用Fig.14 The effect of pH on emulsifying activity

图15 pH对溶液乳化稳定性的作用Fig.15 The effect of pH on emulsion stability

2.7.2 溶液盐离子浓度对鲵皮胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 由图16可知,当离子浓度为0.25 mol/L时大鲵PSC有最优乳化性为0.7 m2/g;在有离子存在的情况下,明胶乳化性要明显优于大鲵PSC。由图17可知,在有离子存在的情况下大鲵PSC乳化稳定性随着离子浓度的上升而呈下降趋势,并且皆低于明胶的乳化稳定性。

图16 离子浓度对溶液乳化性的作用Fig.16 The effect of ion concentration on emulsifying activity

图17 离子浓度对溶液乳化稳定性的作用Fig.17 The effect of ion concentration on emulsion stability

3 结论

本研究通过模拟人体肠胃消化建立体外消化模型,胃蛋白酶最适量为1400 U/g料液,胰蛋白酶最适量为600 U/g,最终得到大鲵皮体外消化率为96.66%。此研究值比路红波,刘俊荣等[18]研究的大比目鱼(88%)、鲑鱼(85%)、鲢鱼(85%)鱼肉蛋白的消化率高。说明大鲵皮更易于人体的消化吸收。

本研究通过响应面实验优化提取工艺,实验表明各因素对工艺影响大小依次为:加酶量>酶解时间>超声时间;最优化参数为加酶量1000 U/mL料液、提取时间33 h以及超声时间12 min,在此条件下有最优大鲵皮胶原蛋白提取率和得率分别为71.94%和15.42%。此结果低于王忠稳等人草鱼皮胶原蛋白得率(19.8%),高于楚水晶等[19]和Sitthipong Nalinanon等[20]研究的马面鱼和大眼鲷鱼皮胶原蛋白得率(分别为9.66%和9.86%)。

通过对大鲵皮胶原蛋白冻干品进行功能性质研究,得出大鲵胶原蛋白能长时间保留至少20%水分;在蛋白浓度为0.4%时有最优起泡性为200%,在pH为7时有最优起泡性为150%,在离子浓度为1.25%时有最优起泡性180%;乳化性结果显示:pH在4时有较好乳化性为1.1 m2/g;在离子浓度为0.25 mol/L时有较好乳化性为0.7 m2/g。

[1]陈德经. 大鲵黏液、皮肤及肉中氨基酸分析[J]. 食品科学,2010(18):375-376.

[2]陈云祥. 浅谈大鲵的产业化开发[J]. 海洋与渔业,2006(11):26-27.

[3]章克家,王小明,吴巍,等. 大鲵保护生物学及其研究进展[J]. 生物多样性,200210(3):291-297.

[4]张神虎. 大鲵药用价值及人工养殖[J]. 广西农业生物科学,2001(4):309-310.

[5]于讯. 汉中大鲵已成为陕西渔业经济一大亮点[J]. 现代渔业信息,2010(3):29.

[6]徐海菊,蔡健,陈江萍. 水产胶原蛋白质的基本特性及其在食品加工中的应用[J]. 浙江农业科学,2010(2):324-327.

[7]陈申如,蔡扬鹏,周琼,等. 鱼骨胶原蛋白的纯化及其特性的初步研究[J]. 食品科学,2006(11):177-81.

[8]张建忠,安辛欣,王林,等. 草鱼皮酸溶性和酶溶性胶原蛋白的提取及性质[J]. 食品科学,2006(12):556-559.

[9]顾赛麒,李莉,王锡昌,等. 人工养殖大鲵皮胶原蛋白的性质研究[J]. 食品科学,2014(9):74-79

[10]于立梅,于新,曾晓房,等. 野生山毛豆蛋白制备及体外消化模拟研究[J]. 食品科学,2010(13):60-64.

[11]李莉,顾赛麒,王锡昌,等. 响应面法优化酶法提取大鲵皮胶原蛋白工艺[J]. 中国水产科学,2013(4):876-883.

[12]王碧,贾冬英,罗红平,等. 皮边角废料提取胶原蛋白的功能特性[J]. 中国皮革,2002(15):13-16.

[13]陶民强. 小麦蛋白质分解物的性能及应用[J]. 食品工业,1997(3):10-12.

[14]董银卯,刘宇红,王云霞. 芦荟保湿性能的研究[J]. 中国农村科技,2006(8):35-36.

[15]Thompson L U,Cho Y S. Chemical composition and functional properties of acylated low phytate rapeseed protein isolate[J]. Journal of Food Science,1984,49(6):1584-1587.

[16]张忠楷. 胶原、明胶和胶原水解物的物理化学性能及护肤功能的研究[D].成都:四川大学,2006.

[17]Kato A,Minaki K,Kobayashi K. Improvement of emulsifying properties of egg white proteins by the attachment of polysaccharide through Maillard reaction in a dry state[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1993,41(4):540-543.

[18]路红波,刘俊荣,吴佳莉. 热塑挤压蒸煮处理对鱼肉蛋白质消化率的影响[J]. 食品工业,2012(3):86-88.

[19]楚水晶,农绍庄,柳春山,等. 酶法提取马面鱼鱼皮胶原蛋白的工艺研究[J]. 食品科技,2010(5):234-237+41.

[20]Nalinanon S,Benjakul S,Visessanguan W,et al. Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper[J]. Food Chemistry,2007,104(2):593-601.

Study on the extraction and functional properties of collagens from the skin of Chinese giant salamander and its digestibilityinvitro

YUAN Tong,WANG Xi-chang*,CHEN Hong-yi,WANG Wei

(College of Food Science and Technology,Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Theinvitrodigestion of the Chinese giant salamander skin was evaluated. The Box-Behnken design response surface test was used to optimize the extraction process of the collagen of the Chinese giant salamander skin. The functional properties of the collagen were also studied. The results showed that:theinvitrodigestion of the Chinese giant salamander skin had reached 96.66%. The optimal condition for the extraction were the combination of adding 1000 U/mL of enzyme,33 h of extraction and 12 min of ultrasonic. The yield reached 71.94%,similar with the model predicted value(73.32%). Under the condition of 20 ℃ and 43% and 81% RH,20% of water could be hold for a long time. The pepsin soluble collagen(PSC)had the best foaming ability when the protein concentration was 0.4 g/100 mL,pH7 and the salt ion concentration was 1.25 mol/L. When pH was 4,salt ion concentration was 0.25 mol/L,the salamander skin collagen had the best emulsibility.

salamander;collagen;invitrodigestibility;response surface;functional properties

2014-11-13

袁通(1989-),男,硕士,研究方向:食品营养与风味,E-mail:chotmat@163.com。

*通讯作者:王锡昌(1963-),男，博士，教授,研究方向:食品营养与安全，E-mail:xcwang@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建设项目(11DZ2280300);上海市教委重点学科建设项目(J50704)。

TS254.4

A

1002-0306(2015)15-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.020