基于响应面法优化α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉工艺及建模的研究

高义霞,王淑芳,王丹丹,王廷璞

(天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水 741001)

基于响应面法优化α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉工艺及建模的研究

高义霞,王淑芳,王丹丹,王廷璞*

(天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水 741001)

以葡萄糖值(DE)为考察指标,利用单因素实验和响应面法研究温度、pH及酶与底物比(E/S)对α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉制糖的影响。应用Lineweaver-Burk和Wilkinson统计法分别求解米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),并建立相应的动力学模型。结果表明:α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉制糖的最佳参数为:pH 6.5,温度55 ℃及E/S=0.12 U/mg,验证值为23.103%±0.454%。在30～50 ℃范围内,Ea=18.977 kJ/moL,ΔH=19.624 kJ/mol。该研究为鹰嘴豆淀粉工业制糖提供理论依据。

鹰嘴豆,酶解,动力学,响应面

鹰嘴豆(CicerarietinumL.),又称桃豆、鸡豌豆等,豆科鹰嘴豆属植物[1],淀粉含量高达40%～60%[2],具有降血糖、降血脂[3]和抗肿瘤[4]等活性。鹰嘴豆淀粉消化率低、酶解过程与淀粉浓度、pH、温度、酶类型及离子强度等有关,常规米氏方程难以真实描述反应过程[5],而实际生产中,须明确酶促反应条件及反应动力学特性,以最大化发挥酶催化作用。随生淀粉酶等新型淀粉酶的出现,直接选择淀粉颗粒作为底物进行水解成为一种趋势。

酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的学科,在酶的结构、功能、作用机制、反应条件及代谢中作用等研究中,具有重要的理论和实践意义。钟昔阳[6]利用α-淀粉酶对小麦面粉进行了动力学研究,结果表明,Wilkinson法预测值与实测值基本吻合。张国权[7]利用真菌淀粉酶对荞麦淀粉进行了动力学研究,并计算了最大反应速度(Vmax)和米氏常数(Km)。张丽华[8]利用响应面法优化莲藕淀粉酶解工艺,得到最优的酶量、温度和时间。姜绍通[9]利用响应面法对芋头淀粉碱性蛋白酶酶解工艺参数进行优化,获得最优的时间、温度、pH和酶量工艺参数。

本实验以温度、pH及酶与底物比(E/S)为因素,通过响应面法优化α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉制糖的最佳工艺,同时对酶解动力学模型进行研究,为鹰嘴豆淀粉工业制糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鹰嘴豆 淀粉含量为87%,新疆天山奇豆生物科技有限责任公司;α-淀粉酶(58.7 U/mg) Sigma产品(Lot:STBB0510,来自枯草芽孢杆菌);酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、亚硫酸氢钠、苯酚、葡萄糖等试剂为国产分析纯 购自生工生物工程股份有限公司。

AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;TGL-20M型高速台式冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;PHS-3D型 雷磁pH计:上海精密科学有限公司;722型可见分光光度计 上海欣茂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹰嘴豆淀粉的酶解 糖含量测定参考3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[10]。称取鹰嘴豆淀粉0.1 g,加入20 mL 0.05 mol/L pH 6.0磷酸缓冲液,搅拌,80 ℃糊化5 min,冷却至50℃,按E/S=0.01 U/mg加入α-淀粉酶,振荡混匀,50 min后迅速沸水灭活5 min,测定吸光度,计算葡萄糖值(DE)。

DE(%)=还原糖量(mg)×100/[87%×淀粉量(mg)]

式(1)

式(2)

式中:v为反应速度(mg/(mL·min),m/V为还原糖含量(mg/mL);t为反应时间(min)。

1.2.2 单因素实验 在温度50 ℃,pH6.0,E/S 0.04 U/mg条件下,考察时间分别为5、10、20、30、40、50、70,90、110、140、170、200 min时其对DE的影响;在pH6.0,E/S 0.04 U/mg,时间50 min条件下,考察温度分别为30、40、50、60、70 ℃时其对DE的影响;在温度50 ℃,E/S 0.04 U/mg,时间50 min条件下,考察pH分别为4、5、6、7、8时其对DE的影响;在温度50 ℃、时间50 min、pH7.0条件下,考察E/S分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 U/mg时其对DE的影响。

1.2.3 酶促反应动力学建模 Michaelis和Menten根据快速平衡学说建立米氏方程,Briggs和Haldane用稳态代替快速平衡态,对米氏方程做了修正,得到更合理的酶促反应动力学过程。推导过程简述如下[11]:

式(3)

式(4)

式(5)

vm=k3E总

式(6)

式(7)

式(8)

式中,k1为ES生成速度;k2、k3分别为ES分解为E+S和P+E的速度;k4为E+P生成ES的速度(反映初期忽略不计)。[S]为底物浓度(mg/mL);E总(U/mL)=[E]+[ES]。利用(8)式求Km和Vm[12]。

1.2.4 酶量对反应速度的影响 在反应时间7 min、pH 7.0、底物浓度20 mg/mL条件下,分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL U/mL酶,测定酶量对反应速度的影响。

1.2.5 响应面法优化酶解工艺 参考李忠海等[13],以pH、温度及E/S为因子,各因子最优点为基准点,确定适度步长,DE为响应值,利用Design-Expert 8.06软件设计Box-Benhnken实验,实验见表1。在最优工艺条件pH6.5,温度55 ℃及E/S 0.12 U/mg进行验证实验。

表1 Box-Benhnken实验因素水平及编码

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

DNS法测定糖含量的标准曲线方程为Y=1.629X-0.042,r=0.997(X为葡萄糖质量,mg,Y为吸光度,A)。

2.2 单因素实验

时间对DE的影响见图1,在0～50 min范围内,随时间的增加,DE逐渐增大,随后出现下降,可能是复合糖生成速度逐渐接近、甚至超过淀粉水解速度,即存在较弱的复合反应,故DE的生成将趋于平稳[14],据此,后续研究中时间选择50 min。

图1 时间对DE的影响Fig.1 Effect of time on DE

温度对DE的影响见图2,在30～50 ℃范围内,随温度升高,酶与底物间碰撞次数增加,DE增加,50 ℃时达最大值,为最适温度;另一方面,当温度增至50 ℃以上时,酶逐渐失活,DE下降。

图2 温度对DE的影响Fig.2 Effect of temperature on DE

pH对DE的影响见图3,pH7.0时,DE达到最大值,为最适pH。pH影响酶活性中心必需基团和底物的解离程度,从而影响酶与底物的结合,并最终影响DE的生成[15]。

图3 pH对DE的影响Fig.3 Effect of pH on DE

E/S对DE的影响见图4,随E/S的增加,酶解速度几乎呈线性增长,原因是反应初期底物过量,酶促反应速度与酶量成正比;随E/S的进一步增大,底物逐渐不足,反应速度趋于平稳[16]。因此E/S选择0.1 U/mg。

图4 E/S对DE的影响Fig.4 Effect of E/S on DE

2.3 响应面分析

Y=-140.651+30.884X1+2.233X2+115.114X3-0.367X1X2-50.268X1X3+3.439X2X3-0.821X12+2.436X22-610.919X32。

Box-Benhnken结果及方差分析见表2和表3,方程具有显著性(p=0.0263),表明模型显著。失拟项p=0.213>0.05,失拟不显著,回归模型与实际情况拟合较好。pH极显著,E/S影响显著,温度影响不显著。各因素影响大小依次为pH、E/S及温度。交互项影响均不显著。最优工艺为:pH 6.5,温度55 ℃及E/S 0.12 U/mg。在此条件下进行验证,结果见表4。

表2 Box-Benhnken实验设计表及结果

表3 回归模型系数显著性检验及其方差分析

表4 验证实验

验证实验平均值为(23.103%±0.454%,n=6),RSD=1.964%,模型有效,可用于鹰嘴豆淀粉酶解参数的优化。酶解效率较低,其原因一方面由于α-淀粉酶首先作用于较容易水解的无定形区,随后残留的结晶区将部分地限制其水解[17],另一方面与淀粉分子中直链淀粉与支链淀粉的比例、颗粒大小、形状、结晶结构和结晶度等有关[18]。另外,鹰嘴豆中脂类化合物易与直链淀粉形成复合物,该复合物对淀粉颗粒的糊化、膨胀和溶解具有较强的抑制作用,对酶水解耐受性强[19]。

2.4 酶量对酶促反应速度的影响

酶量与反应速度的关系见图5,当底物过量时,酶促反应速度与酶量成正比。时间与反应速度的关系见图6,在0～7 min时间与反应速度线性较好,测定时间太短,反应速度误差较大,测定时间太长,则线性程度降低,综合考虑,确定酶促反应线性测定时间为7 min。

图5 酶量对酶促反应速度的影响Fig.5 Effect of enzyme concentrationon reaction velocity

图6 反应时间的确定Fig.6 Determination of reaction time

2.5 Lineweaver-Buck法求解参数

V-S曲线见图7,以1/V为纵坐标,1/S为横坐标,见图8,Y=48.546X+5.054,r=0.992。计算得Vm=0.198 mg/(mL·min),Km=9.605 mg/mL。

图7 反应速度与底物浓度的关系Fig.7 Relationship of reaction velocityand substrate concentration

图8 双倒数作图Table 8 Double-reciprocal plot

2.6 Wilkinson统计法求解参数

2.6.2 泰勒展开式求精校解 Wilkinson法求得精确解为Vm=0.132 mg/mL·min,Km=5.736 mg/mL。

2.6.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法的比较 由表5可知,Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法计算结果有一定的差别。当淀粉浓度较低时,Lineweaver-Buck法[20]取倒数后误差较大,偏离直线较远,且[S]适合范围一般为在0.33 Km～2Km,因此影响Km和Vm的准确性,但该法方便快速,计算量小[21]。Wilkinson统计法结果可靠[22]。综合考虑各方面因素,最终采用Wilkinson统计法计算结果,最终得出Vm=0.132 mg/(mL·min),Km=5.736 mg/mL。

表5 Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法数据比较

2.7 Ea及ΔH计算

在30～50 ℃范围内,反应速度随温度的增加而增大,以lnv对1/T(×103)作图,见图9,呈直线关系,用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程拟合。

式(9)

式中:R为气体常数8.31{J/(mol·K)};Ea为活化能(kJ/mol);B为积分常数。

K3=A×exp(-Ea/RT)

式(10)

式中,A为指前因子{mg/(mL·min)}。

以lnV为纵坐标,1/T(×103)为横坐标,Y=4.654-2.284X,r=0.97。求得Ea=18.977 kJ/moL,A=104.962 mg/(mL·min)。

lnKs=-ΔH/RT+lnC

式(11)

K3≥K2,Ks≈Km,以不同温度下Km与1/T回归,见图10,以lnKs为纵坐标,1/T(×103)为横坐标,Y=7.078-1.76X,r=0.99。求得ΔH=19.624kJ/mol。

图9 lnv与1/T的关系Fig.9 Relationship between lnv and 1/T

图10 lnKs与1/T的关系Table 10 Relationship between lnKs and 1/T

3 结论

本实验结合单因素实验和响应面法优化α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉的工艺参数,并对酶解动力学进行研究。结果表明:酶解工艺为:pH 6.5,温度55 ℃和E/S 0.12 U/mg。在此条件下,DE验证值为23.103%±0.454%,RSD=1.964%。利用Lineweaver-Burk及Wilkinson统计法进行了数学回归,并分析比较后选择Wilkinson统计法,求解得动力学参数Km=5.736 mg/mL,Vm=0.132 mg/(mL·min)。在30～50℃范围内,Ea=18.977 kJ/moL,ΔH=19.624 kJ/mol,该模型推导过程中,各因子影响水解速度的数据拟合,方程相关性高,表明用米氏方程对α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉的动力学过程进行描述和模拟式有效的。

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Study on the processing optimization and modelling of enzymolysis for Chickpea starch based on response surface method

GAO Yi-xia,WANG Shu-fang,WANG Dan-dan,WANG Ting-pu*

(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui 741001，China)

Using dextrose equivalent value(DE)as an index,the effect of temperature,pH and the ratio of enzyme to substrate concentration(E/S)on enzymolysis of chickpea starch with α-amylase were explored based on single experiment and response surface method. The Michaelis constant(Km),Maximum velocity(Vm)and corresponding kinetics modeling were also established by Lineweaver-Burk plotting and Wilkinson statistical method,respectively. The results indicated that the optimal parameters were pH6.5,temperature 55 ℃ and E/S value 0.12 U/mg,and the verification value was 23.103%±0.454%. Ea and ΔH were 18.977 kJ/mol and 19.624 kJ/mol in the temperature range of 30 ℃ to 50 ℃,respectively. The study might provide a theory basis for industrial production of sugar from chickpea starch.

Chickpea;enzymolysis;kinetics;response surface method

2014-10-21

高义霞(1982-)，女，硕士研究生，讲师，从事食品化学研究，E-mail:egaoxy@yeah.net。

*通讯作者:王廷璞(1965-)，男，研究员，从事食品化学研究，E-mail:15293557513@163.com。

国家自然科学基金(31360603)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0087-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.010