植物激素对三七愈伤组织增殖的影响

2015-08-02田蕾李云芳金朝霞张良张宗申郭启根于振艳

周口师范学院学报 2015年5期

田蕾，李云芳，金朝霞，张良，张宗申，＊，郭启根，于振艳

（1.大连工业大学辽宁省发酵工程重点实验室，辽宁大连116034；2.河南省健康伟业生物医药研究股份有限公司，河南郑州450001）

三七（Panaxnotoginseng）为五加科人参属植物，享有“金不换”“南国神草”“人参之王”等美誉[1－2].其根茎和肉质根为名贵的中药，具有止血、散淤、消炎、止痛、滋补等功效，花有清热的作用[3].三七主要产于云南文山和广西等地，已有四百多年的栽培历史，是中国传统的名贵中药材[4].由于三七生长周期长、易染病、管理技术复杂等因素，再加上有性繁殖会直接导致产量下降和品质退化，近年来人们尝试用组织培养技术等无性繁殖手段，改变三七传统的有性繁殖生产途径，希望扩大获得原药或其有效成分的来源[5].

与传统的栽培相比，利用组织培养技术生产三七的替代品可以不受土地、环境、气候等因素的影响.目前，关于三七组织培养技术的研究很少，本文对三七愈伤组织培养中的激素因素进行深入研究，旨在为三七大规模工业化生产奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

以大连工业大学珍稀濒危药用植物细胞工程实验室用云南文山三七种子制备的无菌苗为外植体，诱导出愈伤组织、继代培养.

1.2 方法

1.2.1 试验方法

挑选质地均一、生长良好的三七愈伤组织，分别在单独添加2，4－D、6－BA或 KT的培养基上培养，研究单一因素的浓度变化对三七愈伤组织生长的影响[6].在上述三组试验的基础上，采用正交试验的方法，设计2，4－D、KT 和6－BA 三种激素组合，以不同浓度配比添加到基础培养基中，探究三种激素共同作用于三七愈伤组织的效果.因素和水平见表1.

表1 正交试验因素水平表

以MS为基础培养基，添加30g/L蔗糖和5 g/L琼脂粉.将1g鲜重的愈伤组织接种在装有50 g固体培养基的250mL三角瓶中，在25±1℃条件下暗培养30d，然后收获、称重和计算.

1.2.2 愈伤组织增殖率的计算方法

鲜重:本文所述鲜重为10个培养瓶中三七愈伤组织鲜重（g）的平均值.

干重:本文所述干重为愈伤组织在70℃下烘干至恒重的重量.

ΔW＝W2－W1；

P＝（ΔW/W1）×100%；

ΔW:愈伤组织生长量（g）；

W1:愈伤组织接种量（g）；

W2:愈伤组织收获量（g）；

P:愈伤组织增殖速率（%）.

2 结果与讨论

2.1 2，4－D对三七愈伤组织增殖的影响

由图1可以看出，三七愈伤组织在不同浓度的2，4－D培养基中均能生长，并且生长效果较为显著.其中增殖速率最大的为添加1.0mg/L 2，4－D的培养基中的三七愈伤组织，其平均鲜重达到4.537g，干重达到0.298g，为乳白色、质地疏松，具有易分离和易分化的特征.随着2，4－D浓度的增加，三七愈伤组织的鲜重呈逐渐下降的趋势，但当2，4－D浓度为2.0mg/L时，出现小幅度的上升趋势.上述结果表明，2，4－D作为组织培养的常用植物生长调节剂，能够促进三七愈伤组织的快速增殖.

2.2 6－BA 与2，4－D配比对三七愈伤组织增殖的影响

由图2可以看出，三七愈伤组织在 MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5 mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L）的培养基中，生长量均有增加，其中愈伤组织增殖速度最快的为MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5mg/L，其鲜重达到5.034g，干重达到0.329g，明显高于未添加6－BA的培养基中的愈伤组织.随着6－BA浓度的升高，愈伤组织的鲜重及干重呈逐渐下降的趋势，当其浓度高于1.0mg/L时，愈伤组织鲜重逐渐小于未添加6－BA培养基中的愈伤组织.由此可见，当6－BA与2，4－D共同作用于三七愈伤组织时，在一定程度上能够促进三七愈伤组织的快速增殖，但是其浓度配比是关键，如果6－BA浓度太高反而会抑制三七愈伤组织的生长.

图1 2，4－D浓度对三七愈伤组织增殖的影响

图2 6－BA与2，4－D配比对三七愈伤组织增殖的影响

2.3 KT对三七愈伤组织增殖的影响

将三七愈伤组织接种于 MS＋2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5mg/L＋KT（0mg/L、0.5mg/L、1.0 mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L）的培养基中，培养30d后，三七愈伤组织生长状况出现明显差异.当激素配比为2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.5 mg/L＋KT时，KT浓度增大，愈伤组织的鲜重也增加.但是由图3可以看出，与未添加KT的愈伤组织（见图3－1）相比，随着KT浓度的增大（见图3－2、图3－3、图3－4、图3－5、图3－6），三七愈伤组织颜色逐渐加深，由嫩黄色变为暗黄色，表现出褐化趋势.

图3 KT浓度对三七愈伤组织增殖的影响

2.4 2，4－D、6－BA 和KT对三七愈伤组织增殖的影响

采用正交设计方法，进行16个组合试验，每组3个平行.在培养基中加入2，4－D、6－BA 和 KT三种激素的不同组合，以三七愈伤组织的增殖率为指标进行极差分析和方差分析，结果见表2、表3、表4.极差分析的结果（见表3）表明，各因素对三七愈伤组织增殖速率影响的顺序为2，4－D＞6－BA＞KT，其中最优组合为 A2B1C3，即2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L.虽然通过极差分析，已经得到了各因素影响的主次顺序及最优组合，但为了能够进一步地了解三种激素对三七愈伤组织增殖速率影响的显著性，又对结果进行了方差分析.由方差分析结果（见表4）可知，2，4－D对三七愈伤组织增殖诱导作用非常显著，6－BA影响显著，KT影响不显著，但也不能将其忽略为误差.

综合极差分析和方差分析的结果，以三七愈伤组织增殖速率为指标进行正交试验时，得出的最佳激素组合为2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L，该培养基中的三七愈伤组织生长快、质地疏松，呈嫩黄或乳白色.三种激素中2，4－D对三七愈伤组织增殖速率的影响最为显著.

3 结论

单一激素2，4－D浓度为1.0mg/L时，能够明显促进三七愈伤组织的快速增殖；将1.0mg/L 2，4－D与不同浓度的6－BA配比，在6－BA浓度小于1.0mg/L时，二者组合有利于三七愈伤组织的生长，比单独添加2，4－D生长速度快；在最优组合1.0mg/L 2，4－D＋0.5mg/L 6－BA 中添加不同浓度的KT，发现随着KT浓度的增大，愈伤组织虽然保持一定的生长速度，但其颜色却有不同程度地加深，甚至出现褐化现象.根据正交试验结果，2，4－D 1.0mg/L＋6－BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L是最适合三七愈伤组织生长的激素组合，不但其鲜重、干重和增殖速率等指标都达到最佳，且愈伤组织的色泽和质地均良好，是后续建立三七悬浮细胞培养和细胞分化体系的优良材料.