高脂及糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中eNOS eNOS 和ET-1ET-1蛋白表达的研究*

张成梅 李一锋 甘美舍 申树林 郑 程 李广裕 梁季鸿广西医科大学第一附属医院男性科 （南宁 530021）

高脂及糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中eNOS eNOS 和ET-1ET-1蛋白表达的研究*

张成梅 李一锋 甘美舍 申树林 郑 程 李广裕 梁季鸿**
广西医科大学第一附属医院男性科 （南宁 530021）

摘要目的 探讨高脂及糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和内皮素-1 （ET-1）蛋白表达的变化及其可能的机制。方法 58只SPF级雄性SD大鼠随机分成3组：（1）对照组（n=14），普通饲料喂养；（2）高脂组（n=15），高脂饲料喂养24周后在原饲料配方中加入含0.2%硫氧嘧啶继续喂养；（3）糖尿病组（n=29），高脂饲料喂养24周后腹腔注射20mg/kg STZ；于实验开始后36周末，检测大鼠血糖、血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、胰岛素水平；成模后用阿朴吗啡诱导并观察大鼠阴茎勃起功能变化；采用 Western blot 检测大鼠阴茎海绵体组织eNOS和ET-1蛋白表达。结果 血糖、胰岛素、血脂检测结果显示成功建立了高脂和糖尿病模型。与对照组相比，高脂及糖尿病组大鼠勃起功能明显下降， eNOS蛋白表达显著降低，而ET-1显著升高（P＜0.05）；与高脂组相比，糖尿病组eNOS与ET-1表达进一步失衡，且阴茎勃起功能障碍较高脂组加重。结论 糖尿病和高脂血症导致勃起功能障碍的发病机制可能与阴茎海绵体组织内eNOS和ET-1表达失衡密切相关。

关键词糖尿病; 高脂血症; 一氧化氮合酶; 勃起功能障碍

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是一种男性常见病，发病率逐年上升。阴茎勃起的本质是一系列的神经血管活动。正常阴茎勃起很大程度上依赖于阴茎组织中足够的舒血管物质及正常的平滑肌细胞舒缩状态。血管舒张因子与收缩因子之间的平衡对平滑肌状态有重要影响，其中，内皮素-1 （ET-1）与一氧化氮（NO）间的平衡可能起主要作用[1]。高脂血症和糖尿病作为一种全身性、血管性的疾病，可导致各个器官的损害，阴茎的海绵体组织也不例外。ED的发生又往往早于其他伴有明显内皮损伤的心血管疾病如全身动脉粥样硬化，冠心病等，被认为是此类疾病的早期警报[2]。通过测量内皮细胞分泌物血浓度来了解内皮功能（NO/ET等）一般意义不大，因为这些物质的半衰期很短，除了血管内皮分泌外, 还可能为局部分泌[3]。目前，关于ED研究大多集中在检测NO合成的关键酶各亚型的表达，单方面强调 NO作用。ET-1在大鼠阴茎海绵体组织的蛋白表达，及其与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达变化跟大鼠ED之间的关系，目前报道仍然不多。

本研究通过建立大鼠高脂血症和糖尿病动物模型，主要检测大鼠勃起功能及阴茎海绵体eNOS 和ET-1蛋白的表达情况，揭示高脂血症、糖尿病引起ED的发病机制。

材料与方法

一、动物

SPF级雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠58只，鼠龄10周，体质量250～300g，由广西医科大学动物实验中心提供，4只/笼，自由饮水，环境温度20～25℃，光照: 白天12h/夜晚12h，交替进行。进入研究前交配实验证实均有正常的性功能（由与发情雌鼠交配证实）。

二、主要试剂及仪器

链脲佐菌素（STZ, Sigma公司）；阿朴吗啡（APO，Sigma公司）； 一抗（均购于abcam公司）：Rabbit polyclonal to eNOS；Mouse monoclonal TR.ET.48.5] to Endothelin 1；rabbit polyclonal to Actin Loading Control ；荧光二抗：IRDye 800CW goat nti-rabbit IgG(H+L)、IRDye 800CW goat anti-mouse gG(H+L) 、Odyssey双色红外荧光成像系统（ 美国I-COR 公司）；ACCU-CHEKⓇAdvatage血糖仪及配套试纸； 日立7600全自动生化分析仪。

三、高脂模型及糖尿病模型建立

高脂饲料配方[4]：基础饲料55%，猪油 15%，蔗糖15%，蛋黄10%，3%～5%食盐和2%胆固醇，由北京饲料公司制作。实验前对大鼠实验性喂养1周。然后随机分成3组：对照组、高脂组和糖尿病组。对照组（n=14）普通饲料喂养。高脂组（n=15）高脂饲料喂养24周后在原饲料配方中加入含0.2%硫氧嘧啶，继续喂养。糖尿病组（n=29）高脂饲料喂养24周后禁食16h，再一次性腹腔注射STZ 20mg/kg，其他两组大鼠腹腔内注射柠檬酸钠缓冲液。STZ注射3d后，尾静脉取血，血糖仪检测，任意时间血糖浓度＞16.67 mmol/L为糖尿病造模成功。成模后每周测血糖一次，血糖不达标者则剔除[5]。最终筛选出15只大鼠为糖尿病大鼠。

四、勃起功能检测

参考Heaton[6]的方法；实验开始前将大鼠称量后放入观察笼中，适应环境10min，室内保持安静，灯光调暗，仅够观察即可。称取5mgAPO加入到125mL维生素C及生理盐水溶液中，APO终浓度为40μg/mL，按80μg/100g于大鼠颈项皮肤松软处，行皮下注射，注射完毕后立即将大鼠放入观察笼中，启动录像设备（HDR-XR150E,SONY中国上海）观察30min，记录阴茎勃起次数，阴茎充血及末端阴茎体露出为勃起 1 次，并计算大鼠勃起率，即有阴茎勃起的大鼠数量占每组大鼠总数的百分比 。

五、动物处理

APO试验结束后3d，大鼠禁食12～16h后，称量，取尾静脉血测空腹血糖（Fasting Blood glucose，FBG），大鼠麻醉后颈动脉取血，离心取血清， -20℃冰箱保存备用，迅速剪开下腹，分离出阴茎海绵体组织，取前段迅速固定于4%多聚甲醛溶液中，用于包埋切片，用于免疫组化检测和马森染色，取阴茎中后端放入冻存管，-80℃冰箱保存，用于Westorn blot检测蛋白。

六、代谢指标测定

全自动生化分析仪测血清中总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平，放免法测空腹胰岛素（Fasting insulin，FINS），计算稳态胰岛素抵抗指数[7]（HOMA - IR index：空腹血糖FBG×空腹胰岛素FINS/ 22.5）。

七、Western blot blot

定量分析各组eNOS和ET-1在阴茎组织的蛋白表达。取大鼠新鲜阴茎海绵体中后段组织约100mg，剪碎，液氮研磨加超声粉碎 ，冰上裂解，提取总蛋白， Bradford 法测蛋白浓度，变性。eNOS、ET-1分别制备8%和12%十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶（SDS - PAGE），行电泳、转膜、封闭非特异抗原，eNOS 加eNOS一抗（1:250）4℃摇床孵育过夜，PBST洗膜后抗兔荧光二抗（1:10000）室温孵育2 h；ET-1 加ET-1一抗（1:500）4℃摇床孵育过夜，PBST洗膜后抗鼠荧光二抗（1:4000）室温孵育 2 h。内参加兔抗鼠β-actin一抗（1:1000）4℃过夜及抗兔荧光二抗室温孵育，再次洗膜后分别于Odyssey双色红外荧光成像系统进行扫膜， 采用Odyssey V3.0软件分析，以目的蛋白/β-actin蛋白条带吸光度值作为蛋白表达强度。

八、统计学分析

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS16.0软件进行分析处理，多组均数比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两组间比较，其中方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett's T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、代谢指标

36周末，高脂组及糖尿病组大鼠的TC、LDL-C及胰岛素水平明显高于对照组（P＜0.05）；而糖尿病组TG表达水平跟对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），且高脂组TG水平低于糖尿病组和对照组（P＜0.05）；高脂组与糖尿病组HDL-C水平相似，两者无统计学差异（P＞0.05），但都高于对照组（P＜0.05）； 高脂组血糖水平没有升高，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而糖尿病组空腹血糖显著高于高脂组和对照组 （P＜0.05）；3组大鼠的体质量对照组最高，高脂组次之，糖尿病组最低；而HOMA-IR趋势与体质量相反，糖尿病组最高，高脂组次之，对照组最低，3组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），（表1）。

表1 3组代谢指标比较 （x±sxs）

二、勃起功能检测

注射APO后，高脂组有3只大鼠能勃起，糖尿病组仅有1只勃起，而对照组大鼠均能勃起，可见糖尿病组和高脂组的大鼠的勃起率明显降低（P＜0. 05）。与对照组相比，高脂组及糖尿病组阴茎勃起次数显著降低（P＜0. 05）（表2）。

表2 大鼠阴茎勃起次数及勃起率（x±sxs）

三、eNOSeNOS和ET-1ET-1蛋白表达

在140KD和24KD附近分别检测出eNOS和ET-1特异性条带，以β-actin作为内参，采用Odyssey V3.0软件定量分析eNOS和ET-1的蛋白表达：对照组、高脂组和糖尿病组eNOS蛋白表达分别为：0.3757± 0.0407、0.0491±0.0045和0.0327±0.0034。3组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其中高脂组和糖尿病组eNOS蛋白表达明显低于对照组，与高脂组相比，糖尿病组eNOS蛋白表达更低。ET-1蛋白表达趋势与eNOS相反，在对照组、高脂组和糖尿病组分别为：0.5690±0.1587、1.1235±0.1834和1.3484± 0.2247。3组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），高脂组和糖尿病组ET-1蛋白表达明显高于对照组，与高脂组相比，糖尿病组ET-1蛋白表达进一步升高，（图1）。

讨 论

糖尿病、高脂血症与ED的关系已成共识，高脂血症和糖尿病都是导致ED发生的重要危险因素，但是两者诱发ED的机制十分复杂。研究报道发现[8]ET-1在1型和2型糖尿病性ED动物模型以及病人血浆中表达水平均明显升高，提示其在ED发病中具有重要作用。

本实验应用高脂喂养诱导高脂血症模型及高脂喂养联合小剂量STZ诱导糖尿病模型，在诱导36周后各代谢指标检测结果显示：高脂组虽有胰岛素、TC 及LDL-C水平明显上升，但血糖未见升高，出现明显的高胆固醇血症；糖尿病组血糖、胰岛素、TC、LDL-C水平明显高于对照组。本实验高脂组大鼠出现严重的脂代谢紊乱并伴有胰岛素抵抗，糖尿病组大鼠出现高血糖、高胰岛素血症、脂代谢紊乱，表明高脂血症及糖尿病模型成功可靠；并通过阿朴吗啡试验成功筛选出高脂及糖尿病性ED模型。

图1 western blot 检测eeNNOOSS和EETT--11的蛋白表达

一般认为内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在内皮细胞中持续合成释放NO，在促使阴茎充勃起分并维持勃起状态起到关键作用。而海绵体内皮和平滑肌细胞合成的ET-1通过自分泌或旁分泌作用于细胞膜上的ET-A 和ET-B 两种受体，在维持脉管系统和海绵体平滑肌收缩张力，保持阴茎疲软状态中起主要作用[9]。 Azadzoi 等[10]证实高脂血症及动脉粥样硬化可降低NOS 活性，增加血管收缩物质的产生，降低髂内动脉血流量。脂代谢紊乱时，内皮细胞的损伤和局部大量聚集的炎性细胞成为超氧阴离子的重要来源，使NO合成减少，血管的收缩性增强，且脂质成分与超氧阴离子相互作用，其代谢产物加重内皮细胞的损伤。Chiou等[11]认为高血糖、脂代谢紊乱作用于海绵体内皮系统，使阴茎灌流不足，小血管乃至微血管的病变则引起海绵体缺血、缺氧，导致组织内大量的活性氧（ROS）产生，最终导致内皮系统受到损害，NOS表达减少，内皮依赖性NO合成和释放减少。此外，在糖尿病兔海绵体内发现ET-1 及其受体表达增多。在本实验中，我们对eNOS和ET-1蛋白表达的检测发现：高脂组大鼠阴茎海绵体eNOS表达显著降低而ET-1表达升高（P＜0.05）。这提示高脂血症的代谢紊乱能导致大鼠阴茎海绵体eNOS表达下降以及海绵体血管内皮ET-1表达升高，两者的失衡导致内皮功能障碍引起血管舒缩异常，从而影响勃起功能。

此外，本实验还发现在高脂血症的基础上并发高血糖症可导致大鼠阴茎勃起次数进一步降低（P＜0.05），且阴茎勃起率亦低于单纯高脂血症模型，该结果提示在高脂血症基础上并发高血糖症可导致ED进一步加重。研究发现高血糖症可增加ROS的生成，ROS可降低NO生物活性, 减少细胞内四氢叶酸的水平，并通过 eNOS 产生过氧酸盐，ROS还可以激活PKC -α、PKC-β和PKC-δ，导致eNOS表达水平降低，并可增加内皮细胞中ET-1的表达，从而导致血管内皮功能障碍[12, 13]。Quehenberger等[14]研究表明高糖环境中 晚期糖基化终末产物（AGEs）与其受体RAGE的结合激活核转录因子-κB（NF-κB）的表达，可引起NF-κB依赖性的ET-1高表达。我们的研究结果显示，糖尿病组eNOS蛋白表达低于高脂组，而ET-1蛋白表达则高于高脂组，这一发现提示高脂血症基础上并发高血糖症所导致的ED加重的机制与eNOS和ET-1的表达进一步失衡密切相关。

综上所述，糖尿病和高脂血症与ED关系密切，糖尿病和高血脂症通过高血糖、脂质紊乱等因素使调节血管张力的血管舒张因子和血管收缩之间的平衡被打破，在大鼠阴茎组织中主要表现为eNOS表达下降和ET-1表达升高，两者的失衡导致内皮功能障碍，引起血管舒缩功能异常，从而导致ED。

参 考 文 献

1 吴晓军, 张家华, 宋波, 等. L-Arginine及衰老对大鼠阴茎组织中NO、ET-1的影响. 第三军医大学学报 2004; 26(4): 307-309

2 Miner MM, Kuritzky L. Erectile dysfunction: a sentinel marker for cardiovascular disease in primary care. Cleve Clin J Med 2007; 74 Suppl 3: S30-S37

3 朱郇荣, 孙祥宙, 黄燕平, 等. 勃起功能障碍与血管内皮功能相关性研究及其影响因素. 北京大学学报•医学版2010; 42(4): 418-420

4 刘莉, 芦晔, 许峰锐. 大豆异黄酮对膳食诱导型代谢综合征大鼠糖脂代谢、血清瘦素及FFA的影响. 中医药学报 2012; 40(5): 85-87

5 程晨, 林英立, 陈业刚, 等. 大鼠糖尿病性勃起功能障碍模型的实验研究. 中国男科学杂志 2010; 24 (8): 33-35, 41 6 Heaton JP, Varrin SJ, Morales A. The characterization of a bio-assay of erectile function in a rat model. J Urol 1991; 145(5): 1099-1102

7 Abbasi F, Reaven GM. Evaluation of the quantitative insulin sensitivity check index as an estimate of insulin sensitivity in humans. Metabolism 2002; 51(2): 235-237

8 Disanto ME. Contractile mechanisms in diabetes-related erectile dysfunction. Curr Pharm Des 2005; 11(31): 3995-4010

9 付卫华, 鄢俊安. 参与阴茎勃起的外周递质信号通路及其与ED发生的关系. 重庆医学 2010; 39(20): 2787-2789

10 Azadzoi KM, Goldstein I, Siroky MB, et al. Mechanisms of ischemia-induced cavernosal smooth muscle relaxation impairment in a rabbit model of vasculogenic erectile dysfunction. J Urol 1998; 160 (6 Pt 1): 2216-2222

11 Chiou WF, Liu HK, Juan CW. Abnormal protein expression in the corpus cavernosum impairs erectile function in type 2 diabetes. BJU Int 2010; 105(5): 674-680

12 Triggle CR, Ding H. A review of endothelial dysfunction in diabetes: a focus on the contribution of a dysfunctional eNOS. J Am Soc Hypertens 2010; 4(3): 102-115

13 Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 2005; 54(6): 1615-1625

14 Quehenberger P, Bierhaus A, Fasching P, et al. Endothelin 1 transcription is controlled by nuclear factor-kappaB in AGE-stimulated cultured endothelial cells. Diabetes 2000; 49(9): 1561-1570

（2014-12-08收稿）

**通讯作者, E-mail: jihongliang@126.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.004

中图分类号R 587.1; R 698.1

*基金项目资助: 国家自然科学基金配套经费资助（项目编号：81260123)

Protein expression of eNOS and ET-1 in the corpus cavernosum of erectile dysfunction rat with hyperlipidaemia and diabetes＊

Zhang Chengmei, Li Yifeng, Gan Meishe, Shen Shulin, Zheng Cheng, Li GuangYu, Liang Jihong**Department of Andrology, the First Affi liated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China Corresponding author: Liang Jihong, E-mail: jihongliang@126.com

AbstractObjective To study the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and endothelin 1 (ET-1) in the corpus cavernosum of erectile dysfunction rat with hyperlipidemia and diabetes and explore its mechanism. Methodsthods Total of 58 male SD rats were randomly divided into three groups including the control group (n=14), high-fat group(n=15)and diabetes group (n=29). The rats in the control group were fed with normal feed, the rats in high-fat group and diabetes group were fed with lipid rich food for 24 weeks, and then the formor were given with 0.2% oxygen pyrimidine lipid rich food to keep feeding , while the later given with 20 mg/kgSTZ by intraperitoneal injection. Thirty-six weeks later, levels of fasting blood glucose, serum TG, TC, LDL-C, HDL-C and fasting insulin levels were measured respectively; The spontaneous erectile response induced by APO was observed; The expression of eNOS and ET-1 in corpus cavernosum tissue were detected by western blot. Resultssults The results of fasting blood glucose, fasting insulin and blood lipid showed that the rat models with hyperlipidemia and diabetes were established successfully; Compared with that of the control rats, erectile function and the expression of eNOS decreased remarkably, whereas the expression of ET-1 was incresed signifi cantly(P all<0.05) in high fat and diabetes group. Compared with that of high-fat group, the imbalance of eNOS and ET-1 and the erectile dysfunction were more severe in diabetes group. Conclusionusion The pathogenesis of diabetes and hyperlipidemia induced erectile dysfunction may be closely related to imbalance expression of eNOS and ET-1 in corpus cavernosum tissues.

Key wordsords diabetes mellitus; hyperlipidemias; nitric oxide synthase; erectile dysfunction