全自动精浆锌检测方法的建立及评价*

陆金春卢坤刚张红烨冯瑞祥. 武警江苏总队南京医院检验科 （南京 008）;. 南京欣迪生物药业工程有限责任公司; . 南京医科大学附属南京医院检验科

全自动精浆锌检测方法的建立及评价*

陆金春1**卢坤刚2张红烨3冯瑞祥1
1. 武警江苏总队南京医院检验科 （南京 210028）;
2. 南京欣迪生物药业工程有限责任公司; 3. 南京医科大学附属南京医院检验科

摘要目的 建立全自动精浆锌检测方法并对其准确性、重复性和线性范围等进行评价。方法 利用终点法检测精浆锌浓度，并在全自动生化分析仪上建立检测参数，并评估该方法的试剂空白吸光度、准确性、重复性和线性范围，同时与目前临床上常用的化学比色法精浆锌检测试剂盒进行比较。结果 试剂空白吸光度平均为0.028。3份高、中、低锌浓度的精浆样本重复测定10次，其CV值分别为0.67%、2.04%和4.18%。采用回收率分析来评价准确性，回收率范围为95.68%～103.81%。精浆锌浓度在0.2～7 mmol/L范围时，具有良好的线性关系（r2=0.9944）。以精浆锌检测试剂盒（化学比色法）作为对照试剂，全自动检测法作为试验试剂，两者对115例精浆样本的检测结果没有显著性差异[（2.51±1.26） mmol/L vs （2.54±1.17） mmol/L，t=-1.589，P=0.115]，且呈显著正相关（r2=0.9686，P＜0.01）。结论 本研究建立的全自动精浆锌检测法有较低的试剂空白，重复性和准确性较好，且与目前临床上使用的化学比色法有很好的一致性。该法操作简单、快速，精浆样本无需稀释，适合临床上大批量样本的检测筛查，大大节省了人力和试剂成本。

关键词锌/分析; 精液

人精浆中含有丰富的锌，其浓度大约是血浆的数十倍甚至上百倍[1]。锌不仅在正常睾丸发育中起重要作用，而且在精子发生和维持精子活动率上起作用[2, 3]。锌缺乏时，垂体促性腺激素和雄激素水平降低，继而可导致性腺机能减退、精子发生障碍和第二性征发育不全[3]。精浆中的锌主要来自前列腺，其被认为是评价前列腺分泌功能的重要指标之一[4, 5]。研究显示，自身免疫性前列腺炎、慢性前列腺炎、男性生殖道感染、精索静脉曲张、脊索损伤、吸烟等均可导致精浆锌降低[5-8]，从而导致精子参数异常。黏度高的精液样本精浆锌亦显著降低[9]。检测精浆锌可监测生殖道感染和某些药物或环境污染物等对前列腺分泌功能的影响以及相应的治疗效果[10, 11]。精浆锌的测定亦可用于法医学鉴定[12]。

目前，文献报道的精浆锌的检测方法主要为原子吸收光谱分析法[9, 13]和手工化学比色法[4, 14]。前者需要特定的仪器，且需对标本进行特殊处理；而后者，随着实验室自动化检测的发展，在临床上的使用也受到一定限制。为此，我们通过广泛阅读文献，建立了以化学比色法为基础的全自动精浆锌检测方法，并对其进行了评价，现报告如下。

材料与方法

一、试剂和仪器

试剂组成包括：R1试剂，主要由[1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚]（PAN）、氯化铵、氨水、氟化铵、十二烷基硫酸钠（SDS）和甲醇组成；2 mmol/L锌标准液。PAN、氯化铵和甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；氟化铵和硫酸锌购自西陇化工股份有限公司；SDS购自阿拉丁试剂（中国）有限公司；氨水购自上海凌峰化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯以上级别。检测仪器为迈瑞BS380全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

二、检测原理

锌与PAN反应可生成红色络合物，在540～550 nm波长处有较强的吸收峰，根据标准液浓度和吸光度即可计算出精浆样本中的锌浓度。

三、检测方法

精液样本液化后，3 000×g离心15 min，取上层精浆直接上机检测，仪器自动检测标本并给出结果。基本参数为：主波长：546 nm；副波长：660 nm；分析方法：终点法；R1试剂：300 μl；样本量：3 μl；孵育时间：300 s。

四、试剂空白吸光度

用纯化水替代精浆样本进行测试，记录测试启动时的主波长下的吸光度值（A1）和5 min后的吸光度值（A2），A2即为试剂空白吸光度。试验重复5次。

五、线性分析

用纯化水配制7、6、5、4、3、2、1、0.2 mmol/L的锌溶液，以此溶液作为标本，以2 mmol/L锌标准液定标后，仪器自动检测并给出结果。以理论值和实际检测结果绘制相关曲线，计算相关系数（r）。

六、重复性分析

选取高、中、低锌浓度的精浆样本3份，分别用全自动生化分析仪检测10次，计算变异系数（CV）。

七、回收率分析

选取2份精浆标本，用全自动生化分析仪检测其锌含量，然后分别加入一定量的锌标准液（3.18 mmol和4 mmol），混匀后再次检测4份样本的精浆锌浓度，计算各自的回收率。

八、临床对照试验

选取液化良好的精液标本115份，3 000×g离心15 min获取上层精浆，精浆标本来源于南京军区总医院生殖遗传研究室。分别用本研究的全自动检测法和精浆锌检测试剂盒（天津瑞爱金生物科技有限公司）进行检测，具体操作按各自的说明书进行。计算两者的相关系数（r），并进行配对t检验分析。

九、统计学分析

所测数据以x±s表示，用SPSS17.0统计学软件进行Pearson相关性分析和配对t检验，线性关系作图以Excel软件进行，P＜0.05为有统计学显著差异或有显著相关性。

结 果

一、试剂空白吸光度

测试剂5次，其空白吸光度平均为0.0 2 8 （0.026～0.030）。

二、线性分析

结果显示：锌浓度在0.2～7 mmol/L范围时，具有良好的线性关系（r＞0.99），见图1。

图1 锌检测的线性分析

三、重复性分析

3份高、中、低锌浓度的精浆样本重复测定10次，结果浓度分别为（5.08±0.034）、（3.09±0.063）和（0.55±0.023） mmol/L；CV值分别为0.67%、2.04%和4.18%，均低于5%。

四、回收率分析

2份精浆样本所测锌浓度分别为1.33和1.28 mmol/L，前者分别加入3.18和4 mmol锌标准液后，所得锌浓度分别为4.40和5.10 mmol/L，回收率分别为97.56%和95.68%；后者分别加入3.18和4 mmol锌标准液后，所得锌浓度分别为4.63和5.11 mmol/L，回收率分别为103.81%和96.78%。

五、临床对照试验

以精浆锌检测试剂盒（化学比色法）作为对照试剂，全自动检测法作为试验试剂，两者的检测结果分别为（2.51±1.26）mmol/L和（2.54±1.17）mmol/L，两者比较没有统计学意义（t=-1.589，P=0.11 5）。而且，两者结果呈显著正相关（r=0.984，P＜0.01），见图2。

图2 全自动检测法和化学比色法精浆锌检测结果相关性分析

讨 论

精浆中的锌可稳定精子细胞膜和维持精子染色质稳定性[15]。精浆中的锌对精液凝固和液化亦起作用，射精时，精液形成凝块需精液凝固蛋白和锌的共同作用，锌结合凝固蛋白后，可改变凝固蛋白的结构，从而促进凝胶形成，随后，这些结合锌的蛋白又可作为前列腺特异抗原（PSA）的底物，进而被水解，精液随之液化[1,16]；精浆中的锌亦具有抗氧化作用[17]，可清除活性氧；接触重金属铅、镉、铬等可导致精子质量降低[18]，而补充锌可拮抗铅、镉等的有害效应[19]；另外，锌还有抗阴道毛滴虫的作用和抗菌作用[20]。

精浆锌在男性生殖活动中起重要作用，研究显示，不论是补充无机锌（硫酸锌）还是有机锌（丙酸锌），均可明显改善精子数、精液量、精子形态、前向运动精子百分率、精子DNA完整性、精液液化、体内激素状态、热应激导致的精子损伤，甚至可用于预防和治疗吸烟引起的不育等[13, 17, 21-25]，精浆中适当的锌浓度是正常精子功能所必需的。但如果精浆中锌浓度过高，锌将在精子主段的线粒体中累积[26]，精子存活率和活动率将显著降低[3, 9]，且对透明带（ZP）诱导的顶体反应（AR）有不利效应[27]。因此，准确评估精浆锌浓度就显得较为重要了。以往研究检测精浆锌浓度基本为手工分析法和原子吸收光谱分析法，临床上的应用非常有限。基于此，本研究建立了精浆锌的全自动检测法，并对其准确性和重复性以及线性关系等进行了评价。

本研究建立的全自动精浆锌检测法，试剂空白吸光度平均为0.028，非常低，提示试剂对检测结果的干扰非常小。将3份高、中、低锌浓度的精浆样本重复测定10次，CV值分别为0.67%、2.04%和4.18%，均低于5%，满足了一般生化检测的要求。根据临床化学体外诊断试剂盒——中华人民共和国国家标准GB/T26124-2011的要求[28]，采用回收率分析来评价准确性。4份精浆标本的回收率范围为95.68%～103.81%，均在允许范围之内。精浆锌浓度在0.2～7 mmol/L范围时，具有良好的线性关系（r2=0.9944）。

在对方法学评价的基础上，我们亦进行了临床对照试验。以精浆锌检测试剂盒（化学比色法）作为对照试剂，全自动检测法作为试验试剂，分别检测了临床上的115例精浆样本，结果显示，两者的检测结果没有显著性差异（t=-1.589，P=0.115），且呈显著正相关（r2=0.9686，P＜0.01）。提示，本研究建立的全自动检测法与目前临床上使用的手工法有很好的一致性。

总之，本研究建立的全自动精浆锌检测方法相比于目前的手工法，准确性和重复性显著提高，检测过程更为简单，精浆无需稀释可直接使用全自动生化分析仪检测，检测速度大为增加，并且可以成批检测。需要注意的是，精浆锌与禁欲时间呈正相关[27]，故解释检测结果时要考虑禁欲时间的影响；由于精浆锌与果糖浓度呈逆相关，精浆锌浓度可能受前列腺和精囊腺分泌功能的双重影响，而精浆总锌浓度可能是反映前列腺分泌功能和精液质量更合适的指标；要将质量控制体系引入精浆锌的全自动检测中，在目前没有商品化的室内和室间质控品的情况下，冻融精浆标本可以作为锌测定的室内和室间质控品。未来，我们将致力于精浆锌检测的质控物和校准物的研究，以及将此全自动检测法在临床上进一步推广应用。

参 考 文 献

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（2014-10-18收稿）

**通讯作者, E-mail: lujc@androl.cn

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.007

中图分类号R321.1

*基金项目资助: 南京市江宁区科技发展计划项目（2012Aa20）

Establishment and evaluation of automatic assay on level of seminal plasma zinc＊

Lu Jinchun1**, Lu Kungang2, Zhang Hongye3, Feng Ruixiang1
1. Department of Laboratory Science, Nanjing Hospital, Jiangsu Corps, the Armed Police Force, PLA, Nanjing 210028, China;
2. Nanjing Xindi Biological Pharmaceutical Engineering Co., Ltd, Nanjing 211112, China;
3. Department of Laboratory Science, Affi liated Nanjing Hospital of Nanjing Medical University / Nanjing First Hospital, Nanjing 210006, China
Corresponding author: Lu Jinchun, E-mail: lujc@androl.cn

AbstractObjective To establish an automatic assay for the level of seminal plasma zinc, and evaluate its accuracy, repeatability and linear range. Methodsthods The concentration of zinc in seminal plasma was analyzed by an automatic biochemical analyzer, and the detection parameters of endpoint method were established. Subsequently, the reagent blank absorbance, accuracy, repeatability and linear range of the automatic method were evaluated, and the results obtained from the method and the seminal plasma zinc detection kit (a colorimetric method) commonly used in clinical laboratories were compared. Resultssults The average absorbance of reagent blank was 0.028. The coeffi cients of variation (CV) for 3 seminal plasma samples with high, middle and low zinc concentration detected for 10 times, respectively, were 0.67%, 2.04% and 4.18%. The accuracy of the automatic method was evaluated by a recovery assay, and the recovery rates ranged from 95.68% to 103.81%. There was a good linear relationship (r2=0.9944) when the seminal plasma zinc concentration ranged from 0.2 to 7 mmol/L. When the the seminal plasma zinc detection kit (a colorimetric method) was as the control, and theautomatic method as the test reagent, there was no any statistical difference ([2.51±1.26] mmol/L vs [2.54±1.17] mmol/L, t=-1.589, P=0.115) but a signifi cant positive correlation (r2=0.9686, P<0.01) between them for the results of 115 seminal plasma samples. Conclusionusion The established automatic method for analysis of seminal plasma zinc concentration has low reagent blank, good repeatability and accuracy, and fi ne concordance with the colorimetric method commonly used in clinical laboratories. The method is simple, rapid, and suitable for screening large numbers of samples, and greatly saves the cost of manpower and reagents, and the seminal plasma samples don’t need to be diluted.

Key wordsords zinc/analysis; semen