花生作图亲本间分子标记的多态性分析

许梦琦 李双铃 任艳 石延茂 王辉 尹亮 袁美 刘志文

摘要：利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4种分子标记技术研究了花生（Arachis hypogaea Linn）作图亲本花育22号与“950527”间的分子多态性。经过初筛和复筛，822对AhMITE引物、1 106对SSR引物、460对SRAP和731对SRAP-RGA引物在两亲本间表现稳定多态性的数量分别为101、207、25和72对，多态性比率分别为12.3%、 18.7%， 5.4%和9.8%。结果表明，SSR标记揭示作图亲本间多态性的效率最高，其次是AhMITE标记，SRAP标记的多态性和重复性最差。

关键词：花生（Arachis hypogaea Linn）；多态性；分子标记；SSR；AhMITE；SRAP；SRAP-RGA

中图分类号：S565.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2763-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.054

Polymorphic Analysis of Molecular Markers between Mapping Parents in Peanut

XU Meng-qi1，2，LI Shuang-ling2，REN Yan2，SHI Yan-mao2，WANG Hui2，YIN Liang2，YUAN Mei2，LIU Zhi-wen1

（1. School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China； 2. Shandong Peanut Research Institute/Shandong Provincial Key Laboratory of Peanut/Key Laboratory of Peanut Biology and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Polymorphism between two mapping parents Huayu 22 and “950527” in peanut（Arachis hypogaea Linn） was screened by using four types of molecular marker technology， including AhMITE，SSR，SRAP and SRAP-RGA. After primary and secondary screening with 822 pairs of AhMITE，1 106 pairs of SSR，460 pairs of SRAP and 731 pairs of SRAP-RGA primers， 101，207，25 and 72 pairs of primers were detected， respectively，showing stable polymorphism between the two parents， and the polymorphism ratios were 12.3%，18.7%，5.4% and 9.8%，separately. The results showed that， SSR markers are most efficient in revealing polymorphism between the mapping parents， followed by AhMITE markers， and SRAP markers are the worst in polymorphism and repeatability.

Key words： peanut（Arachis hypogaea Linn）； polymorphism； molecular markers； SSR； AhMITE； SRAP； SRAP-RGA

花生（Arachis hypogaea Linn）栽培种（2n=4x=40）起源于玻利维亚南部和阿根廷北部，是世界上重要的经济和油料作物之一，也是许多发展中国家植物油和蛋白质的重要来源[1]。花生的常规育种方法存在育种周期长、对目标单株的选择效率低、成本高等难以克服的缺点[2]。20世纪80年代以来，随着分子生物学技术的发展，分子标记技术被广泛应用于现代作物遗传育种研究的各个方面，并取得了丰硕成果[3-6]，许多过去无法进行的研究在分子标记的帮助下得以开展，大大加快了花生育种工作的进程[5，7]。花生产量、油分含量和抗逆性均为复杂的数量性状，从分子水平研究其遗传基础必将有助于改良这些性状，从而育成高产、高油、多抗的花生新品种，而高质量遗传图谱则是在分子水平上研究复杂性状的基础和保证[8-12]。

花生根结线虫病是中国大部分花生生产区经常发生的一种具有毁灭性的病害。目前，花生根结线虫病波及面积越来越广，病害趋势也逐步加重，严重影响了花生的产量和品质，大大降低了农民的收入。而防治此种病害的农药如神农丹、呋哺丹等都是高毒高残留农药，不仅污染环境，而且对人类的健康造成了不可估量的危害。农药的使用终归治标不治本，培育抗根结线虫病花生品种才是控制花生根结线虫病危害的最理想的途径[13]，而分子遗传连锁图谱的构建可为抗病基因的定位、克隆以及抗根结线虫病分子育种奠定基础。本研究以农艺性状优良但对花生根结线虫病表现感病的花生材料花育22号和表现高抗的“950527”为作图亲本，利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4种分子标记技术研究了花育22号、“950527”、抗病混和池和感病混和池间的分子多态性，以期为花生高质量遗传图谱的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用花生亲本为农艺性状优良但感病的材料花育22号和高抗材料“950527”，以花育22号为父本，“950527”为母本进行杂交获得F1代。第二年经分子水平鉴定和田间表型鉴定，选择真杂种F1代单株混收获得F2代种子，编号为AA72。第三年种植F2代种子于山东省花生研究所线虫病圃，播种后35 d逐株进行抗病性鉴定，鉴定标准参照文献[14]。鉴定后将感病和抗病植株各随机选取30个单株并提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 花生基因组DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。通过1%琼脂糖凝胶检测DNA质量，并用紫外分光光度计测量浓度后，将亲本DNA稀释到10 ng/μL待用。将挑选出的感病和抗病的F2单株DNA分别混合构成感病混合池和抗病混合池DNA，使其终浓度均为10 ng/μL。

1.2.2 引物 所用SSR引物来自Zhao等[15]，AhMITE引物来自Shirasawa等[16，17]，SRAP和SRAP-RGA引物来自王洁[18]。

1.2.3 PCR反应体系和热循环程序 PCR反应体系为10 μL，含5 μL 2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]、0.3 μL正向和反向引物（10 μmol/L）、2 μL基因组DNA（10 ng/μL）、2.4 μL ddH2O。

各标记PCR反应扩增程序为：①AhMITE标记。94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸10 min； 4 ℃保存。②SSR标记。94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。③SRAP标记。94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环5次；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。④SRAP-RGA标记： 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min， 45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环5次；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 电泳检测和数据分析 AhMITE和SSR标记使用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，180 V电压电泳1 h；SRAP和SRAP-RGA标记用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，500 V电压电泳2 h。电泳缓冲液均为0.5×TBE。电泳结束后，用0.1% AgNO3进行染色，并拍照保存。

多态性比率为多态性标记数占筛选标记总数的百分比。

2 结果与分析

利用两个亲本DNA和两个混合池DNA对822对AhMITE引物、1 106对SSR引物、460对SRAP引物组合和731对SRAP-RGA引物组合进行了初次筛选。图1为部分引物的筛选结果，如图1中的箭头所示，图1A中的AhMITE0615，图1B中的SSR-C5、C12、D6，图1C中的M7fE22均在亲本间表现多态性；图1D中的R25RE05和R25RE09则在亲本间和感抗池间均表现多态性。由表1可知，在所筛选的4种标记中，两亲本间SSR标记的多态性比率最高（39.0%），其次是AhMITE标记（29.7%）和SRAP-RGA标记（28.9%），SRAP标记最低（23.3%）；感抗池间的多态性比率明显低于感抗亲本间，SSR标记的多态性比率最高，其次是SRAP-RGA标记和AhMITE标记，SRAP标记最低。从初筛结果可以看出，两个作图亲本间表现多态性的分子标记总数达到933，远远达不到高密度分子遗传图谱构建的要求。前人的研究表明，花生栽培种间遗传基础狭窄，因此基于PCR扩增的第二代分子标记的多态性水平比较低，可用于花生图谱构建的多态性分子标记数量还十分有限[6，15]。

为了进一步验证初筛结果的重复性和稳定性，用初筛得到的多态性分子标记对两个亲本和感抗池间DNA进行第二轮和第三轮筛选。由于复筛后感病混合池和抗病混合池间多态性的重复性很低，因此统计多态性分子标记时只统计感抗亲本间多态性比率（表2）。与初筛结果相比，4种分子标记的多态性标记数量大大减少，AhMITE多态性标记数由244减少到101，SSR多态性标记数由431减少到207，SRAP多态性标记数由107减少到25，SRAP-RGA多态性标记数由211减少到72。从多态性比率来看，SSR标记的多态性比率最高（18.7%），AhMITE标记（12.3%）和SRAP-RGA标记（9.8%）次之，SRAP标记最低（5.4%）。经3次筛选出的多态性分子标记总数达到405，可用于F2代群体单株的基因分型，为下一步的花生栽培种分子遗传图谱的构建和抗线虫基因定位奠定了基础。

3 讨论

3.1 关于初筛与复筛的多态性标记数量

本研究中，复筛得到的多态性标记数量远远低于初筛结果。造成此现象的原因可能是在初筛的扩增过程中，由于模板或引物浓度过高、Taq酶量过多、引物特异性差、扩增循环次数过多及Mg2+浓度偏高等原因引起PCR扩增中出现一些非特异扩增。这些非特异扩增导致初筛结果统计的多态性标记数量偏高，但并不能稳定保持，因此在复筛过程中并没有出现。同时， 为了保证下一步的F2代群体单株基因分型的准确性和重复性， 在复筛结果统计中只统计差异条带强的标记数。PCR扩增中使用的天根生化科技（北京）有限公司生产的2×Taq PCR MasterMix包含Buffer，dNTPs和Taq酶，对低质量和微量的DNA均具有极好的扩增效果，其中Taq酶和Mg2+的浓度固定，在下一步的试验中可尝试在不影响扩增效果的前提下，优化Mix的用量或降低PCR循环次数，以降低非特异扩增出现的概率，并得到更清晰、稳定的条带。

3.2 4种分子标记的比较

本研究中不同分子标记的多态性比率差异较大。AhMITE标记、SSR标记、SRAP标记及SRAP-RGA标记的多态性比率分别为12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，其中SSR标记的多态性比率最高，其次是AhMITE标记和SRAP-RGA标记，而SRAP标记的多态性比率最低。在扩增的稳定性和重复性方面，AhMITE和SSR标记较好，SRAP-RGA标记次之，SRAP标记最差。综合来看，SSR标记在花育22号与“950527”这对作图亲本中的应用效果最好，而SRAP标记的多态性和重复性最差。

3.3 不同作图亲本间的多态性比较

本研究对作图亲本花育22号与“950527”进行了822对AhMITE引物、1 106对SSR引物、460对SRAP引物组合和731对SRAP-RGA引物组合的初筛和复筛，其中表现稳定多态性的标记数量分别为101、207、25和72，多态性比率分别为12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，整体的多态性比率为13.0%。山东省花生研究所细胞工程实验室对花生的另一个作图群体的亲本花育22号与D99的多态性标记的筛选结果为，在823对AhMITE引物、2 172对SSR引物、460对SRAP引物组合和507对SRAP-RGA引物组合中，筛选出了多态性稳定的84对AhMITE引物、188对SSR引物、8对SRAP引物组合和8对SRAP-RGA引物组合，4种标记的多态性比率分别为10.2%、8.7%、1.7%和1.6%，整体的多态性比率为7.3%。比较这两对作图亲本的分子标记多态性比率，本研究中花育22号与“950527”这对作图亲本的多态性比率整体略高。因此可以得出结论，花育22号与“950527”这对作图亲本的多态性比率在正常范围内。

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