板桥党参中不同溶剂提取物体外抗氧化活性的研究

张驰++刘信平++张红玲

摘要：以板桥党参（Banqiao Codonopsis pilosulc）为原料，分别用去离子水、0.5 mol/L NaCl溶液、75%乙醇、0.1 mol/L KOH溶液为溶剂提取蛋白质。采用水提醇沉法，以石油醚脱脂，95 ℃热水浸提，Sevage试剂脱蛋白，乙醇醇析提取多糖。考马斯亮蓝G-250染色法测定提取的蛋白质含量，苯酚-硫酸法测定多糖含量，同时测定不同溶剂提取的蛋白质和多糖的还原能力以及对超氧阴离子自由基（O■-·）和羟自由基（·OH）的清除效果。结果表明，板桥党参富含蛋白质和多糖，并且都具有一定的还原能力和清除超氧阴离子自由基（O■-·）的能力，其中以水溶性蛋白质清除自由基的能力最强，多糖清除自由基的能力最弱，但是对羟自由基（·OH）都没有清除效果。

关键词：板桥党参（Banqiao Codonopsis pilosulc）；蛋白质；多糖；抗氧化活性

中图分类号：S567.5+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2640-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.021

Study on Antioxidant Activity in Vitro of Banqiao Codonopsis pilosulc

by Different Solvent Extraction

ZHANG Chi，LIU Xin-ping，ZHANG Hong-ling

（Biological Scientific and Technical College of Hubei Institute for Nationalities/

Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： Take Banqiao Codonopsis pilosulc as raw material，the protein was extracted respectively with deionized water，0.5 mol/L NaCl solution，75% ethanol，0.1 mol/L KOH solution as solvents. Using water extraction and alcohol sedimentation method， with petroleum ether degreasing，95 ℃ hot water extraction， Sevage reagent deproteinization， polysaccharide was extracted with ethanol precipitation. The protein content of extract was determined by coomassie brilliant blue G-250 dyeing method. The polysaccharide content of extract was determined by the method of phenol-sulfuric acid. At the same time， the reducibility and the removal effect of superoxide anion free radical （O2-·） and hydroxyl free radical （·OH） of different solvents were investigated. Results showed that Banqiao Codonopsis pilosulc were rich in protein and polysaccharide， which had certain reducibility and the removal effect of superoxide anion free radical （O2-·）， water-soluble proteins with the strongest ability of scavenging free radicals， polysaccharides with the weakest scavenging free radicals， but for hydroxyl free radical （·OH） without effect.

Key words： Banqiao Codonopsis pilosulc； protein； polysaccharide； antioxidant activity

党参为我国常用的传统补益药，古代以西上党地区出产的党参为上品，大量试验及临床研究表明党参或党参提取物对心血管系统、中枢神经系统、血液及造血功能、消化系统及免疫功能均有有益的作用[1-3]。板桥党参（Banqiao Codonopsis pilosulc）系桔梗科（Campanulacea）党参属（Codonopsis）植物川党参（Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根，产于享有“中国硒都”之称的湖北省恩施市的板桥镇[1]。该党参具有药用、食用、饮用、保健等多种功效，被誉为全国“四大名党”之首，享誉海内外。中医常以党参替代人参入药，现代医学研究表明板桥党参有治疗心血管病、延缓衰老等功效[4，5]。板桥党参在内质和外形上较国内其他品种均有明显差别，形成了自己独特的质量特征。

自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的代谢产物。在正常情况下，人体自由基的产生和清除作用处于动态平衡之中，但若是体内自由基产生过多或消除过慢，则会给机体组织和细胞造成损伤，进而影响碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等物质代谢，可引起机体的衰老，并诱发癌症、心血管疾病等诸多疾病[6-8]，因此需要清除多余自由基。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前普遍使用的抗氧化剂类药物分两种，一种是人工合成的，另一种是从植物中提取出来的（称天然抗氧化剂），大量研究表明，党参具有抗氧化之功效，目前对于板桥党参的研究虽多，但大多集中在化学成分、药用机理、生理功能等方面的研究，国内外尚未见到关于板桥党参不同溶剂提取物在抗氧化活性方面的研究。该研究对于了解板桥党参抗氧化生理功效的机理、从党参中开发天然活性物质以及增加党参的利用度等都具有十分重要的意义。endprint

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将板桥党参采收后洗净，用去离子水冲洗后置于60 ℃烘箱中48 h烘干，用植物样品粉碎机粉碎后过60目筛，贮存于干燥器内备用。

考马斯亮蓝G-250（上海绿鸟科技发展有限公司），牛血清蛋白（上海蓝季科技发展有限公司），葡萄糖（Sigma公司），铁氰化钾（上海紫一试剂厂），邻苯三酚（西亚试剂有限公司），石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、Tris试剂、盐酸、硫酸铵、氯化钡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氢氧化钾、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、磷酸、三氯化铁、三氯乙酸（TCA）、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢等，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2 仪器与设备

植物样品粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；电子天平（上海天平厂）；S21-3磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；HWS-l2电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；DGX型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；SJ-4A pH计（上海雷磁仪器厂）、低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；722型可见分光光度计（上海光学仪器厂）、超纯水器（韩国HUMAN TECHPIA株式会社）；SZ-93A自动双重蒸馏水器（上海亚荣生化仪器厂）；B-191喷雾干燥仪（瑞士BUCHI公司）。

1.3 方法与步骤

1.3.1 不同溶剂提取样品中的蛋白质及蛋白质含量的测定 不同种类的蛋白质具有不同的分子量、结构、性质，本研究参照姚敏[9]在富硒灵芝中不同种类蛋白质的提取方法，对党参中不同种类蛋白质进行了提取、分离与测定。

1）水溶性蛋白质的提取[10]。称取党参样品3份，每份1 g，先用丙酮脱脂4 h，在4 ℃离心15 min，转速5 000 r/min，除去上清液。将丙酮挥发干，加去离子水20 mL，室温下搅拌提取4 h，在4 ℃离心15 min，转速同上，提取2次。合并上清液，加（NH4）2SO4至饱和，于4 ℃冰箱静置过夜，4 ℃离心15 min，转速同上，取沉淀透析至BaCl2检测透析水中SO42-呈阴性为止，通过透析作用对蛋白质进行初步纯化，以除去其中的小分子物质，取蛋白质加去离子水定容至50 mL，测定蛋白质含量和抗氧化活性。

2）盐溶性蛋白质的提取。分别在水溶性蛋白质提取后的残渣中加0.5 mol/L NaCl 溶液20 mL，在室温下提取4 h，离心15 min，转速5 000 r/min，提取2次，合并上清液，加（NH4）2SO4至饱和，4 ℃冰箱中静置过夜，再4 ℃离心15 min，转速同上，取沉淀透析至BaCl2检测透析水中SO42-呈阴性为止，转出蛋白质加0.5 mol/L NaCl溶液定容至50 mL，测定蛋白质含量和抗氧化活性。

3）醇溶性蛋白质的提取。分别在盐溶性蛋白质提取后的残渣中加75%乙醇20 mL，室温下提取4 h，4 ℃离心15 min，转速5 000 r/min。提取2次，合并上清液，加1倍量的去离子水，4 ℃静置过夜，4 ℃离心15 min，转速同上，取沉淀，冻干，75%乙醇溶解并定容至50 mL，测定蛋白质含量和抗氧化活性。

4）碱溶性蛋白质的提取。分别在醇溶性蛋白质提取后的残渣中加0.1 mol/L的KOH溶液20 mL，在室温下提取4 h，4 ℃离心15 min，转速5 000 r/min。提取2次，合并上清液后中和至pH7.0，加（NH4）2SO4至饱和，4 ℃冰箱中静置过夜，再4 ℃离心15 min，转速同上，取沉淀透析至BaCl2检测透析水中SO42-呈阴性为止，将蛋白质转出加0.1 mol/L的KOH溶液定容至50 mL，测定蛋白质含量和抗氧化活性。

5）蛋白质含量的测定。采用考马斯亮蓝G-250 染色法[11]，先用牛血清蛋白作标准曲线，后测定不同溶剂提取的蛋白质含量。

1.3.2 党参多糖的提取及其含量的测定[10]。

1）党参多糖的提取。采用水提醇沉法，称取党参样品3份各1 g，分别加入20 mL石油醚，室温下搅拌提取4 h脱脂，过滤，至石油醚完全挥发，分别加去离子水20 mL室温搅拌提取4 h，提取后4 ℃下5 000 r/min离心15 min，提取2次，合并上清液，95 ℃热水浸提，减压浓缩后用Sevage法即氯仿∶正丁醇（4∶1）[12]除去蛋白质，加入4倍量95%乙醇，静置过夜，取多糖沉淀，用85%乙醇洗涤3次，加去离子水定容至50 mL备用。

2）多糖含量的测定。采用苯酚-硫酸法[10]，用葡萄糖标准溶液作标准曲线，测定多糖的含量。

1.3.3 提取物抗氧化活性的测定

1）不同溶剂提取物的总还原能力的测定。采用铁氰化钾还原法[13，14]，在10 mL试管中依次加入板桥党参样品提取液2.0 mL、2.5 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6） 2.0 mL和1% K3 Fe（CN）6 溶液2.0 mL混合均匀，50 ℃水浴加热20 min，流水快速冷却后再加入10%三氯乙酸（TCA）溶液2.0 mL，混合均匀，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL，依次加入去离子水2.0 mL、0.1% FeCl3溶液0.4 mL，充分混匀，静置10 min，以去离子水作参比，在700 nm下测定其吸光度（D），D值越大表示还原能力越强[13-15]。

2）超氧阴离子清除率的测定。采用邻苯三酚自氧化[15，16]原理测定，对照组取50 mmol/L 的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2） 4.5 ml，加去离子水4.2 mL，混匀，置于37 ℃水浴保温20 min，立即加入37 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚0.5 mL，迅速摇匀，倒入比色皿中，以10 mmol/L的HCl溶液作对照，每隔30 s测定D325 nm值，连续测定5 min。样品组按上述步骤在加入邻苯三酚之前，加入样品溶液1 mL，相应减少去离子水的量，同样以10 mmol/L HCl溶液作对照，同样的方法测D值。endprint

抑制率=（ΔD1/Δt-ΔD2/Δt）/ΔD1/Δt×100%

式中，ΔD1/Δt为邻苯三酚自氧化时反应速率， ΔD2/Δt为加入样品液后邻苯三酚自氧化速率。

3）清除羟自由基作用的测定。采用Fenton反应，参照文献[13，17，18]并略作改进，利用Fenton反应产生·OH，在10 mL试管中依次加入0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1.0 mL、pH 7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液2.0 mL和去离子水1.0 mL，充分混匀，加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，边加边摇匀，再加入0.015% H2O2 溶液1.0 mL，置于37 ℃水浴中反应60 min，以体积比为1∶2的缓冲液和去离子水作参比液，在536 nm 波长处测其吸光度D损；按上述操作步骤，用1.0 ml去离子水代替1.0 mL 0.015% H2O2，在536 nm波长处测其吸光度D未；用不同党参提取物代替1.0 mL去离子水，以体积比1∶2∶3的样品、缓冲液、去离子水作参比，在536 nm处测其吸光度D样，按下列公式计算清除率。

清除率=（D样-D损）/（D未-D损）×100%

式中，D样、D损、D未分别为加入样品、不加样品、不加样品和H2O2 体系的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 党参中不同种类蛋白质的含量

考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，标准曲线y=4.905 7x+0.014，R2=0.997 5。由此可以计算出提取的不同种类蛋白质的含量如图1所示，水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白含量分别为1.128、0.781、5.776、3.582 mg/g。

2.2 党参中多糖的含量

苯酚-硫酸法测定多糖含量，标准曲线y=6.705 7x-0.002 3，R2=0.999 3。由此可以计算出板桥党参样品的多糖含量为3.700 6 mg/g。

2.3 不同溶剂提取物的抗氧化活性测定结果

2.3.1 不同溶剂提取物的总还原能力 在还原能力测定反应体系中，不同溶剂提取物溶液可以提供电子，使Fe3+还原成Fe2+， 并与自由基形成较稳定的物质，中断自氧化连锁反应引起体系吸光度增加，表现出抗氧化作用潜力。所得提取物的还原能力比较如图2所示。由图2可知，还原能力大小表现为：水溶性蛋白>碱溶性蛋白>醇溶性蛋白>盐溶性蛋白>多糖。

2.3.2 对O2-·的清除作用 在弱碱性条件下，邻苯三酚迅速发生自氧化，产生超氧阴离子自由基。超氧阴离子自由基清除剂能降低邻苯三酚的自氧化速率，使邻苯三酚自氧化产物在325 nm处的吸收峰减弱。所得提取物对超氧阴离子自由基的清除率比较如图3。由图3可知，水溶性蛋白对超氧阴离子自由基的清除能力最强，醇溶性蛋白的自由基清除能力次之，碱溶性蛋白清除超氧阴离子自由基的能力最弱。

2.3.3 对 ·OH的清除作用 Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应：H2O2+Fe2+→·OH+ OH-+Fe3+，Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，在536 nm波长处有最大吸收峰。当Fe2+-邻二氮菲被·OH氧化为Fe3+-邻二氮菲时，536 nm处的吸收峰消失或减弱。本试验向该反应体系中加入一定含量的样品溶液，如能引起吸光度发生一定程度的变化，表明样品可对·OH的生成产生一定抑制作用。试验测定所得提取物对羟自由基的清除率比较如图4，结果显示，不同溶剂提取的4种蛋白质和多糖对羟自由基均没有清除能力。但pH8.2的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液提取物对·OH自由基的清除率达94.28%，pH6.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液提取物对·OH自由基的清除率仅为14.89%。

3 小结与讨论

根据蛋白质在不同溶剂中的溶解性不同，将板桥党参可溶性蛋白质分成水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白；并用水提醇沉法提取多糖。分别测定提取物各组分中的蛋白质和多糖含量，并研究其不同组分的还原能力以及对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除效果。试验结果表明，板桥党参中多糖含量为3.700 6 mg/g；蛋白质的含量以醇溶性蛋白质含量最高为5.776 mg/g。蛋白质含量多少依次是醇溶性蛋白>碱溶性蛋白>水溶性蛋白>盐溶性蛋白；不同种类蛋白质和多糖都有一定的还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力，其中水溶性蛋白质还原能力以及清除超氧阴离子自由基的能力最强，多糖的还原能力最弱，碱溶性蛋白质清除超氧阴离子自由基的能力最弱；不同种类的蛋白质和多糖几乎没有清除羟自由基的能力。

研究表明板桥党参中富含蛋白质和多糖，并且均具有较强的还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力。板桥党参中的蛋白质和多糖是板桥党参发挥抗氧化活性的主要物质，与其他类似研究的党参具有抗氧化、抗应激以及调节免疫功能等的能力，其主要活性成分之一为党参多糖（CPP）[19，20]相一致。从已有的研究报道看，关于党参多糖的提取分离方法和功能评价较多，但对于党参中的蛋白功能分析未见报道，本研究表明板桥党参富含具有抗氧化能力的蛋白质和多糖，是很有希望的天然抗氧化剂原料，这类抗氧化剂不仅可以被人体消化吸收，还兼具营养和保健特性，具有广阔的应用前景。目前，还未见到国内外对于板桥党参的抗氧化活性方面的系统研究报道，对板桥党参的抗氧化活性成分进行充分开发和利用，具有十分重要的作用。

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