miR- 124- 3p通过负调控Caveolin- 1表达降低N2a/APPswe细胞内Tau蛋白磷酸化水平

向 月，张 雄，杨 军，戴颂阳，李 昱

(重庆医科大学 病理教研室 神经科学研究中心 神经生物学重点实验室， 重庆 400016)



研究论文

miR- 124- 3p通过负调控Caveolin- 1表达降低N2a/APPswe细胞内Tau蛋白磷酸化水平

向 月，张 雄，杨 军，戴颂阳，李 昱*

(重庆医科大学 病理教研室 神经科学研究中心 神经生物学重点实验室， 重庆 400016)

目的探讨在阿尔茨海默病(AD)细胞模型中miR- 124- 3p通过调控Caveolin- 1的表达对细胞内Tau蛋白磷酸化水平的影响。方法体外培养野生型N2a(N2a/WT)和N2a/APPswe细胞，荧光定量PCR及Western blot分别检测miR- 124- 3p、APP和Caveolin- 1的表达；N2a/APPswe细胞分别转染miR- 124- 3p模拟物、Caveolin- 1过表达载体及干扰RNA后，用荧光定量PCR及Western blot分别检测Caveolin- 1、Tau和Tau-Ser404表达。结果与野生型N2a细胞比较，N2a/APPswe细胞中miR- 124- 3p表达降低(P<0.01)，APP表达升高(P<0.01)，Caveolin- 1表达升高(P<0.01)。N2a/APPswe细胞转染miR- 124- 3p模拟物后，Caveolin- 1表达降低(P<0.01)，Tau-Ser404/Tau降低(P<0.01)。N2a/APPswe细胞转染Caveolin- 1过表达载体后， Tau-Ser404/Tau升高(P<0.01)。转染干扰RNA后Tau-Ser404/Tau降低(P<0.01)。结论miR- 124- 3p可能通过调节其靶基因Caveolin- 1的表达而降低Tau蛋白磷酸化水平，在AD中发挥神经保护作用。

miR124- 3p；Caveolin- 1；N2a/APPswe细胞；Tau蛋白；磷酸化

阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseases, AD)是一种起病隐匿的慢性进行性神经系统退行性病变，是老年期最常见的痴呆类型[1]。迄今为止，AD的病因和发病机制尚未阐明，也没有有效的治疗方法。以异常过度磷酸化的Tau蛋白为主要成分的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)是AD的主要病理特征之一，近年来逐渐成为寻找防治AD策略的重要靶标。

微小RNA(microRNA，miRNA) 是一种由19～24个核苷酸组成的内源性单链非编码小RNA。近年来研究发现，miRNA在AD的发生发展过程中起着重要的作用[2]。miR- 124是哺乳动物神经系统中表达最多的miRNA[3]，其参与调控的靶基因编码的蛋白质涉及神经发生分化和学习记忆等多种生物过程[4]。目前，对miR- 124在AD发生发展中的作用研究相对较少。本研究探讨miR- 124调控Caveolin- 1对AD发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：野生型N2a细胞(wildtype，N2a/WT)和稳定表达Swedish家族性突变的人APP695的N2a细胞(N2a/APP695swe)。细胞均由厦门大学许华曦教授提供。

1.1.2 主要试剂：兔抗人APP和鼠抗人Tau多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；抗Caveolin- 1鼠单克隆抗体(BD公司)；山羊抗人Phospho-Tau(Ser404)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；抗β-actin鼠单克隆抗体(北京四正柏生物科技公司)；DMEM、Opti-MEM、标准胎牛血清(Gibco公司)；脂质体LipfectamineTM2000(Invitrogen公司)；G418(Amresco公司)；RNAiso Plus、PrimeSriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara公司)；HRP标记的IgG二抗(北京鼎国生物技术公司)；过表达成熟miR- 124- 3p (miR- 124- 3p mimics)(广州锐博生物公司设计合成)；pcDNA-Caveolin- 1和Caveolin- 1-siRNA(上海英骏生物公司设计合成)；引物均由上海生工生物工程公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组:1)WT组:N2a/WT细胞；2)空白对照APPswe组：N2a/APP695swe细胞；3)阴性对照control组：N2a/APP695swe细胞分别转染miR- 124- 3p mimics、pcDNA3.1-Caveolin- 1、Caveolin- 1-siRNA的阴性对照组；4)转染组：N2a/APP695swe细胞分别转染miR- 124- 3p mimics、pcDNA3.1-Caveolin- 1、Caveolin- 1-siRNA。

1.2.2 细胞培养:N2a/WT细胞培养于含有47%改良型伊格尔培养基(DMEM)、47% 改良型无血清培养基(Opti-MEM)、5%胎牛血清、1%双抗的培养液中；N2a/APP695swe细胞培养于含有47% DMEM、47% Opti-MEM、5%胎牛血清、1%双抗、20 mg G418的培养液中。

1.2.3 生物信息学分析与靶基因预测:采用TargetScanMouse6.2(http：//www.targetscan.org)对miR- 124- 3p靶基因及可能与Caveolin- 1 mRNA的3′UTR结合的microRNA进行生物信息学预测。

1.2.4 脂质体介导细胞转染:取N2a/APP695swe细胞接种于6孔板中，用Opti-MEM培养液培养至细胞汇合度达到50%～60%，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染，miR124- 3p mimics、pcDNA-Caveolin- 1、Caveolin- 1-siRNA终浓度分别为100 pmol/孔、4 μg/孔、100 pmol/孔。培养48 h后收集细胞，进行实验。

1.2.5 实时荧光定量:PCR检测miR- 124- 3p以及Caveolin- 1 mRNA的表达水平: 提取细胞中的总RNA，测定RNA浓度和纯度，按照反转录试剂盒操作程序进行反转录反应合成cDNA，用SYBR Green染料法获得不同样本中的目的基因的相对表达量。通过2-△△Ct算法计算目的基因mRNA相对内参基因表达水平的差异。其中microRNA的检测通过特异的茎环(stem-loop)引物反转录合成cDNA。各引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for realtime-PCR

1.2.6 Western blot:用RIPA/PMSF法提取细胞中的总蛋白，用BCA法测蛋白浓度，变性后等量上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后封闭液封闭2 h，依次与一抗、二抗孵育，利用ECL法检测目的蛋白条带。采用Quantity One软件分析测定条带的吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 利用生物学软件进行靶基因预测

采用TargetScanMouse6.2预测结果提示，miR- 124- 3p靶基因数共1 317个，可能与Caveolin- 1 3′端非编码区(3′UTR)结合的microRNA共4个：miR- 124/124ab/miR- 506、miR- 203、miR- 375、miR- 199ab- 5p。预测Caveolin- 1 3′UTR与miR- 124- 3p结合的匹配序列(图1)。

2.2N2a/WT和N2a/APPswe细胞中APP、miR-124-3p及Caveolin-1的表达

与WT组比较，APPswe组的miR- 124- 3p表达降低(P<0.01)，APP蛋白表达升高(P<0.01)，Caveolin- 1蛋白表达升高(P<0.01)(图2)。

2.3miR-124-3p过表达对靶基因Caveolin-1的表达调控及对Tau-Ser404/Tau蛋白表达的影响

与APPswe组及对照组比较，miR- 124- 3p mimics组Caveolin- 1 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.01)，Tau-Ser404/Tau相对蛋白表达量降低(P<0.01)(图3)。

图1 Caveolin- 1 3′-UTR 和 miR- 124- 3p配对序列预测Fig 1 Predicted consequential pairing of Caveolin- 1 3′UTR and mmu-miR- 124- 3p

*P<0.01 compared with WT group图2 N2a/WT和N2a/APPswe细胞中miR- 124- 3p、Caveolin- 1以及APP的表达Fig 2 Expression of miR- 124- 3p, Caveolin- 1 and APP in N2a/WT and N2a/APPswe cells

2.4Caveolin-1过表达及干扰后对Tau-Ser404/Tau蛋白表达的影响

与APPswe组及对照组比较，pcDNA-Caveolin- 1组Caveolin- 1蛋白表达升高(P<0.01)，Tau-Ser404/Tau相对蛋白表达量升高(P<0.01)(图4)。与APPswe组及对照组比较，Caveolin- 1-siRNA组Caveolin- 1蛋白表达降低(P<0.01)，Tau-Ser404/Tau相对蛋白表达量降低(P<0.01)(图5)。

*P<0.01 compared with control group图3 miR- 124- 3p过表达对Caveolin- 1 mRNA及蛋白和Tau-Ser404/Tau蛋白的影响

*P<0.01 compared with control group图4 Caveolin- 1过表达对Tau-Ser404/Tau蛋白表达的影响Fig 4 Effects of Caveolin- 1 overexpression on the expression of Tau-Ser404/Tau protein levels

*P<0.01 compared with control group图5 Caveolin- 1干扰后对Tau-Ser404/Tau蛋白表达的影响Fig 5 Effects of Caveolin- 1 interference on the expression of Tau-Ser404/Tau protein levels

3 讨论

AD发病率随着年龄的增长而不断上升，是老年人群中仅次于脑卒中、心脑血管疾病及癌症的第4大死亡原因，由于其病因和发病机制尚未充分阐明，因此诊疗手段还非常有限，分子靶向治疗可能为AD的诊疗提供新的策略。miRNA在中枢神经系统中广泛分布， 对神经系统的发育和可塑性起着重要作用，并与多种神经退行性病变的发病机制相关，如AD和帕金森病[5]。miR- 124在神经系统中表达十分丰富[3]，研究发现其可以通过间质-上皮转化指导胎盘间充质干细胞向胰腺祖细胞分化[6]，并且目前已经有研究者提出了miR- 124导致AD发生的可能机制:1)miR- 124靶作用于核糖核酸结合蛋白1(polypyimidine tract binding protein 1，PTBP1)的mRNA，从而调节淀粉样前体蛋白mRNA的选择性剪切，异常的选择性剪切与Aβ沉积有关[7]。2)miR- 124可调节β淀粉样前体蛋白分泌酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1) (Aβ生成的一种关键酶)基因的表达，从而调控Aβ的生成[8]。所有这些提示miR- 124可能成为AD诊疗的重要靶标。Caveolin- 1 是大多数哺乳动物细胞膜上小凹(caveolae)结构的基本组成成分,也是多种信号分子的负性调控蛋白和支架蛋白[9]。研究发现，在AD患者脑组织中Caveolin- 1的蛋白及 mRNA表达上调，大约是对照组的两倍[10]。在猪的肾上皮PK15细胞中研究发现，miR- 124可以靶向调节Caveolin- 1的表达[11]。本研究结果说明， miR- 124- 3p可能通过负调控Caveolin- 1的表达而在AD中发挥作用。

在AD患者脑中，异常过度磷酸化的Tau蛋白大量增加[12]。研究表明，GSK- 3β可以催化Tau蛋白在多个AD相关磷酸化位点上发生过度磷酸化[13]。在大鼠心肌细胞中的研究发现，绿茶多酚能够通过Caveolin- 1调节PKB/GSK- 3β信号通路抑制氧化应激和减轻缺血损伤对心肌发挥保护作用[14]。本研究结果表明, miR- 124- 3p可能通过负调控Caveolin- 1的表达而降低Tau蛋白磷酸化水平，从而在AD中发挥神经保护作用；Caveolin- 1可能是通过影响GSK- 3β的活性而调节Tau蛋白磷酸化水平，为miR- 124- 3p作为AD分子靶向治疗的可能提供了一定的理论依据。

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新闻点击

适当多吃巧克力有助代谢和减肥

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013-11-13报道，许多人都认为吃巧克力容易发胖，于是巧克力成了减肥者的“禁忌”食物，但西班牙最近有研究发现，适当多吃巧克力者的平均体脂肪含量反倒大大低于不吃的人。

这份由西班牙格拉纳达大学(University of Granada)所提出的研究再次证明了先前有研究者提出的类似相关结论。该研究称，在某些方面，常吃巧克力确实有助于减少体脂肪。虽然巧克力所含的热量高，但因为它会加快人体新陈代谢的速度，反倒有助于防止脂肪在体内累积，同时它对血液的循环、血压的稳定以及心脏的健康都有益处。

报告还指出，爱吃巧克力者比起不吃者，其腹部周围的体脂肪确实是更少的，而这与食用者当时是否正在节食或拥有良好的健康生活方式与否并无关系。

巧克力的重要成分类黄酮可可豆对人体的健康有益。它能使脑卒中症状的患病概率降低29%，心脏疾病下降37%。这些黄酮类化合物(茶和红酒中也有)可发挥类似抗氧化剂的作用，有助于清除过量的会破坏细胞的自由基。

巧克力的可可成分含量愈高，黄酮类物质越多，对健康的好处也越大，比如可可含量为40%的黑巧克力所含的黄酮类化合物比白巧克力多5倍以上，并高出一般的牛奶巧克力2倍之多。

饮食缺镁少纤易患糖尿病

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013-11-17报道，中国台湾中央研究院生物医学科追踪研究1 600多人近10年，发现饮食缺乏纤维、镁会使糖尿病罹病概率增加约2倍。

有研究者指出，先前美国“糖尿病预防计划”对3 000个濒临糖尿病的前期个案提供少吃多动的方案，建议每周至少5次、每次30 min快走，并且减少脂肪与热量，以减轻7%体质量，结果个案患糖尿病的风险平均降低50%，提示改变生活习惯胜于预防性用药。

为了解何种饮食可能会增加糖尿病风险，台湾研究者追踪1 600多位30岁以上成年人，发现镁摄取量每天达350 mg、膳食纤维每天达33 g，摄取量充裕的人比较不容易得糖尿病。

相反地，镁摄取量不足到每天小于240 mg者发生糖尿病风险是350 mg的2.73倍，膳食纤维摄取量低到每天小于24 g者的糖尿病风险是33 g者的2.48倍。研究表明，膳食纤维可减缓血糖上升速度，减缓食物被人体吸收，而且帮助血糖稳定，减少饥饿感；镁是叶绿素主要成分，帮助身体代谢糖分，增加对胰岛素的敏感度。

研究者建议，要控制血糖及体质量的人从改变饮食做起，可以多吃深绿色蔬菜、全谷类、豆类、坚果等，增加膳食纤维与镁摄取量，再搭配同样不容易刺激血糖升高的低升糖指数水果，例如芭乐、西红柿、樱桃、草莓，有饱足感且热量较低，减重就不会太辛苦。

miR- 124- 3p inhibits Tau phosphorylation level of N2a/APPswe cells via down-regulating Caveolin- 1 expression

XIANG Yue, ZHANG Xiong, YANG Jun, DAI Song-yang, LI Yu*

(Dept. of Pathology, Institute of Neuroscience, Chongqing Key Laboratory of Neurobiology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo explore the effect of miR- 124- 3p on Tau phosphorylation level through regulating Caveolin- 1 in Alzheimer’s diseases(AD) cell model.MethodsWild type N2a (N2a/WT) and N2a/APPswe cells were culturedinvitro. Real-time fluorescence quantitative PCR(real time-PCR) and Western blot were respectively used to detect the expression level of miR- 124- 3p, amyloid precursor protein and Caveolin- 1; N2a/APPswe cells were respectively transfected by miR- 124- 3p mimics, Caveolin- 1 overexpression vector and Caveolin- 1 siRNA. Real time PCR and Western blot were respectively used to detect the expression levels of Caveolin- 1, Tau and Tau-Ser404.ResultsCompared with wild type N2a cell, the expression of miR- 124- 3p in N2a/APPswe cell was decreased (P<0.01), while APP and Caveolin- 1 were increased (P<0.01). After N2a/APPswe cells were transfected with miR- 124- 3p mimics, the expression level of Caveolin- 1 was decreased (P<0.01) and Tau-Ser404/Tau was decreased (P<0.01);after transfection of Caveolin- 1 overexpression vector, the expression level of Caveolin- 1 was increased (P<0.01) and Tau-Ser404/Tau was increased (P<0.01); after transfection of Caveolin- 1 siRNA the expression level of Caveolin- 1 was decreased (P<0.01) and Tau-Ser404/Tau was decreased (P<0.01).ConclusionsmiR- 124- 3p may reduce the level of Tau phosphorylation and play a neuroprotective role in AD through regulating the expression of Caveolin- 1.

miR124- 3p; Caveolin- 1; N2a / APPswe cells; Tau protein;phosphorylation

2014- 10- 08

：2014- 12- 30

国家自然科学基金(81271426)

*通信作者(correspondingauthor)：liyu100@163.com

1001-6325(2015)05-0579-06

R741.02

：A