化学发光检测光子计数的统计特性

陈文洋，邹明强 ，刘 峰，李锦丰

(1.吉林大学仪器科学与电气工程学院，吉林长春 130021;2.中检国研(北京)科技有限公司，北京 100123;3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

1 引 言

化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)将具有高灵敏度的化学发光系统与高特异性的免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗原或抗体，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学放光标记物，加入化学放光系统的其他相关产物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。它是继放射免疫分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术［1］。

化学发光免疫用发光物作为标记时的灵敏度很高，但是瞬间发光限制了光信号的持续时间。过短的持续时间会导致检测的结果很不稳定，不具有很好的重现性。现有的研究表明，在化学反应系统中加入增强剂能够延长发光信号的持续时间至几十分钟甚至24 h。同时，传统的免疫分析又具有特异性。根据这样的特点，结合传统的免疫分析与化学发光免疫技术，形成了一种新型的标记免疫分析技术，即增强化学发光免疫分析(Enhanced chemiluminescenceimmunoassay，ECLEIA)。增强化学发光酶联免疫分析的检出值最小可达10－15mol/L，其灵敏度比常规的酶免疫分析高3～5个数量级。由于具有灵敏度高、发光量子效率高、使用快速、简便、应用面广、化学发光信号持续稳定时间等优点，增强化学发光酶联免疫分析在免疫分析、蛋白质印迹、核酸检测等诸多领域得到了广泛应用［2-12］。目前化学发光免疫分析中使用最多的4种标记物分别是鲁米诺、吖啶酯衍生物、异鲁米诺及其衍生物、过氧化物酶和碱性磷酸酶，其中鲁米诺是开始应用最早、最有效的化学发光物质之一［13］。化学发光是指物质由于吸收了发生化学反应时的化学能，使反应产物分子从基态跃迁至激发态。处于激发态的分子在回到基态时，便会发射出特定波长的光。从统计角度来说，化学发光发射的光子脉冲与化学发光反应组分含量相关［14-16］。化学发光的检测主要通过光子计数的方式进行。光子计数器作为一种高灵敏度的弱光检测装置，其鉴别阈值、光电倍增管高压等因素对信噪比的影响等已被仪器开发人员进行了大量的研究［17-20］。但是对于检测对象的光子脉冲发射统计规律对检测结果的影响的研究还从未见诸报道，而增强化学发光酶联免疫分析化学发光体系的光子脉冲发射统计过程却又对检测结果有重要影响。

本文首次测量了增强鲁米诺化学发光体系的光子脉冲统计特性，并根据其脉冲发射时间统计特性对化学发光光子计数检测装置的设计进行了数值分析。研究结果表明，增强鲁米诺化学发光体系的光子脉冲发射间隔呈Weibull分布。在化学发光反应烈度较低时，脉冲连续发射的可能性增加;而当化学发光反应剧烈时，由于发光效率降低，所以脉冲连续发射的可能性降低，影响化学发光检测结果的线性，应予以修正。为了保证化学发光的检测结果具有合理的信噪比，应注意在检测仪器设计中对光子计数时间做动态调整。

2 光子脉冲统计特性测试方案及实施

2.1 实验方案

实验采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被-待测抗原-酶(HRP)标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、过氧化氢和化学发光增强剂使其产生化学发光。分别配制不同浓度的增强化学发光体系(光子发射频率不同)。采用示波器记录不同发射频率下共3 014个光子脉冲在光子计数装置中的光电倍增管(PMT)输出波形及最后输出的方波信号。根据波形数据统计不同发射频率下的光子脉冲幅度(PMT输出信号)、宽度、脉冲间隔(输出方波信号)的统计规律。

2.2 测量装置

实验装置为自主开发的96通道增强化学发光免疫检测仪原理样机，如图1所示。其中光电倍增管采用滨松公司的CR110光电倍增管，计数器使用ATMEL公司的ATmega8单片机自带的16位计数器T1(ATmega8晶振频率8 M)。示波器采用Tektronix DPO3000数字荧光示波器(300 MHz，2.5 G/s，记录数据长度 5 M)。测试框图如图2所示。

图1 化学发光检测仪样机Fig.1 Prototype of Chemiluminescence detector

图2 光子脉冲测量实验装置Fig.2 Experimental device of photon pulse measurement

3 结果与讨论

3.1 光子脉冲强度统计特性分析

典型光电倍增管的光脉冲强度分布如图3所示。各级倍增极热电子发射的脉冲高度小于光信号的脉冲高度，脉冲数很多;光阴极的热电子发射及反馈光子的光电激发产生的脉冲高度等于光信号的脉冲高度，脉冲数较少;宇宙射线激发产生的脉冲高度大于光信号的脉冲高度，脉冲数极少。如果采用脉冲高度甄别器对处于高脉冲高度基准(ULD)和低脉冲高度基准(LLD)之间的信号脉冲进行甄别，可实现高信噪比的单光子计数，有利于提高系统的探测灵敏度［21］。

图3 光子脉冲强度分布与噪声信号强度分布图Fig.3 Relationship between the intensity of photon pulse and the intensity of noise signal

图4 实测光子脉冲强度统计Fig.4 Statistics of actual measurement photon pulse intensity

图4给出了对触发计数的3 014个光子脉冲的强度统计，从图中可以看出超低脉冲得到了很好的抑制，脉冲高度统计不存在明显的截止，表明实验系统阈值选取适当。

3.2 化学发光光子计数脉冲宽度统计特性分析

对光子计数器的PMT后信号脉冲的半高全宽进行测量，结果如图5所示。其统计特性呈现Gaussian分布。采用Gaussian拟合计算PMT后光子脉冲半宽度均值为53.6 ns，标准偏差为6.3 ns，测量数为 3 014。

实验结果表明，脉冲整形使光子脉冲最后形成的方波脉冲宽度展宽，并且脉冲宽度的差异也增大了，但统计特征仍然呈现Gaussian分布，如图6所示。Gaussian拟合统计结果均值为89.3 ns，标准偏差为26.5 ns，测量数为3 014。这是由于脉冲整形比较器触发电平低于脉冲信号强度平均值所致。

图5 光子脉冲宽度统计Fig.5 Statistics of photon pulse width

图6 整形后的方波脉冲宽度统计Fig.6 Statistics of the square wave pulse width after shaping

3.3 脉冲间隔与计数频率之间的统计规律分析

从光子计数脉冲整形原理分析，光子脉冲的脉冲宽度和脉冲幅度与光子脉冲频率无关，但光子脉冲间隔与光子脉冲频率(对应化学发光强度)相关。实验测量了不同光脉冲发射频率下的脉冲间隔统计分布，数据表明脉冲间隔符合Weibull分布，如图7所示。

其概率密度函数为［22］:

其中a为尺度参数，b为形状参数，t为脉冲间隔时间。如果用f(t)和F(t)分别表示概率密度函数和分布函数，则

图7 光子脉冲间隔统计分布图Fig.7 Interval statistical distribution map of photon pulse

h(t)为瞬时脉冲发生概率函数。当b=1时，h(t)为常量，此时各种脉冲间隔发生的概率是相等的，也就是满足指数分布;当b＜1时，h(t)是减函数，随着距离上一个脉冲发生时间的延长，下一次脉冲发生的概率减小;当b＞1时，h(t)是增函数，随着距离上一个脉冲发生时间的延长，下一次脉冲发生的概率将增加。

实验测量了平均脉冲频率为3 691，7 368，17 692，28 646，33 085 Hz的几段连续光子脉冲序列的脉冲间隔规律，并根据Weibull分布函数进行了数值拟合，再对所得尺度参数和形状参数随化学发光光子脉冲频率变化关系进行数值拟合，结果如图8所示。尺寸参数a随着频率的增加呈幂级数衰减，表明脉冲平均间距缩小。值得注意的是形状参数b在化学发光频率较低的情况下小于1，表明此时脉冲扎堆连续发射的几率更大，这可能与化学发光反应烈度较低时的局部反应不均匀有关;在高光子脉冲发射频率情况下，b逐渐接近于1，表明化学发光反应逐渐均匀。

当光子脉冲发射频率为5～1 000 kHz时，根据拟合公式推算的堆积引起的脉冲漏记结果如图9所示(假设光子脉冲间距小于2倍光子脉冲宽度，即180 ns时为堆积发生条件)。图中对比了b=1的情况，也就是光子发射完全与间隔无关的情况下堆积发生的概率。脉冲堆积几率随光子脉冲发射率的增加而升高。当光子脉冲发射率较低时，脉冲堆积几率很低;当光子脉冲频率达到300 kHz左右时，脉冲堆积几率已经上升到5%以上。对于实验所采用的化学鲁米诺化学发光反应体系，当化学发光强度增加到100 kHz以上时，化学发光效率开始明显降低，此时发射光子密度低于理想情况，所以堆积几率也有所降低。在实际检测应用中可以根据这一规律对光子计数检测结果进行校正。

图8 光子脉冲间隔统计分布图。(a)尺度参数a随光子频率的变化;(b)形状参数b随光子脉冲频率的变化。Fig.8 Interval statistic distribution map of photon pulse.(a)Variation of scale parameter a with the photon frequency.(b)Variation of shape parameter b with photon pulse frequency.

图9 脉冲堆积与光子脉冲频率的关系Fig.9 Relationship between the pulse accumulation and photon pulse frequency

3.4 化学发光信噪比与化学发光频率和计数时间的关系

化学发光检测信噪比计算公式如下:

式中η为量子效率，R为平均光子流，Rd为暗记数率，t为计数时间。将脉冲堆积引起的计数效率降低引入公式，并计算信噪比随计数时间和光子脉冲频率变化的规律，结果如图10所示。由图10可知:在相同计数时间情况下，计数频率越高则信噪比越高;在相同计数频率情况下，计数时间越长则信噪比越高。

图10 化学发光信噪比与发光频率和计数时间的关系Fig.10 Signal to noise ratio of chemiluminescence vs.luminescence frequency and counting time

化学发光检测的动态范围较大，样品不可重复测量。如果设置固定的积分时间，则未知样品检测结果的信噪比将存在较大差异。因此，在实际化学发光检测中可以实时监控化学发光光子脉冲发射频率，根据图10结果动态调整积分时间，保证测量结果的信噪比处于一个可以接受的范围。

4 结 论

光子计数检测方法结果需要针对化学发光反应的发射光子脉冲的统计特征进行修正。在化学发光检测应用中，考虑样品只能单次使用，为了保证将未知检测样品检测结果信噪比控制在一个合理的范围，应采用动态计数时间方式。总之，对于专用分析仪器的研究除了应考虑检测过程本身因素的影响，还应针对检测对象的特征进行分析，以保证仪器具有良好的适用性。

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