预测微生物学在低温储存原料乳中的应用

赵金海，段楠，常存，姚鸿宾，王东凯，王雷（.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨50020；2.黑龙江省北安市红星农场，黑龙江北安64022）

预测微生物学在低温储存原料乳中的应用

赵金海1，段楠2，*，常存1，姚鸿宾1，王东凯1，王雷1
（1.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨150020；2.黑龙江省北安市红星农场，黑龙江北安164022）

摘要：随着冷藏设备的广泛应用，嗜冷菌及其耐热代谢产物成为影响原料乳质量和乳制品质量的主要因素。以奶站的新鲜原料乳为研究对象，研究春季原料乳中总菌落和嗜冷菌在不同储存温度下的生长情况。使用Gompertz模型建立4℃～14℃储存的原料乳中总菌落和嗜冷菌的生长动力模型，模型可以有效的模拟原料乳中微生物的生长情况。低温储存的原料乳中总菌数与嗜冷菌有一定的相关性。

关键词：原料乳；嗜冷菌；预测微生物学

乳品是易腐的食品，如果储存在不恰当的条件下，就会发生腐败菌和致病菌的生长，诸如乳酸菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、和沙门氏菌此类的致病菌。随着冷藏设备的广泛应用，嗜冷菌成为影响保质期的主要因素。

Ingram将耐冷菌定义为能在≤5℃的条件下生长的微生物[1]。为了便于区别，将“Psychrophile”称为专性嗜冷菌，除去“Psychrophile”部分的“Psychrotroph”称为兼性嗜冷菌，两者合称嗜冷菌。Morita根据微生物最适生长温度以及生长上下限温度对嗜冷菌作出了定义，认为嗜冷菌（Psychrophiles）就是指那些最适生长温度等于或低于15℃，上限温度等于或低于20℃的微生物的总称[2]。在已经了解的嗜冷菌中，细菌就有30多个属，常见如假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、克雷伯氏菌属[3-4]。Craven和Macauley报导86.8%的从4℃储存的巴氏消毒乳中分离的嗜冷菌属于假单胞菌属[5]。吴石金等从155份原料乳样品中分离纯化得到嗜冷菌分离物16株，经微生物分类学性状特点鉴定，确定为假单胞菌10株，微球菌4株，产碱杆菌2株[6]。

假单胞菌属和芽胞杆菌属产生的蛋白酶和脂肪酶在生产乳和乳粉的加热工序后还有活力，当菌体被杀死后释放到液体奶中。Matta和Santo曾报道原料乳中嗜冷菌产生的胞内蛋白酶与超高温灭菌乳（ultra heat treated，UHT）奶胶凝有关[7-8]。嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见的问题，大多数嗜冷菌在4℃～6℃贮存时，能产生耐热的酶类如蛋白酶、脂肪酶等，这些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT处理，导致乳及乳制品风味、品质降低，缩短保质期。

使用预测模型对食品中的微生物的生长情况进行预测，成为食品行业研究的热点，预测模型已经可以应用在蔬菜[9-11]、肉制品[12-14]、水产品[15-16]和乳制品等[17-18]食品中，因此本研究利用预测模型对原料乳中的微生物生长情况进行预测，以期达到快速估算原料乳中微生物数量的目的。

1　材料与方法

1.1原料与试剂

新鲜机械榨取1h内的牛乳，在5 t乳罐中搅拌并快速冷却至4℃，从乳罐中取乳样50 kg，使用碎冰屑保持低温，样品在30 min内送到实验室。将原料乳混匀后进行无菌分装，每只灭菌的1 000 mL三角瓶大约分装500 mL乳样。放入指定保藏温度的摇床，以80 r/min振荡培养。

营养琼脂：广东环凯微生物科技有限公司；脱脂乳粉：黑龙江省完达山乳业股份有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2主要仪器与设备

DELTA320pH计、AL-204分析天平：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；JD500-2电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；ZDX-30KBS自动灭菌锅：上海申安医疗器械厂；HZQ-F160全温震荡培养箱、DL-CJ-1N医用超净工作台：哈尔滨东联公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌落总数的测定

采用GB/T4789.2-2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》方法检测菌落总数[19]，对不同储存温度和时间的原料乳中菌落总数进行测定。

1.3.2嗜冷菌的测定

采用ISO 17410-2001《Milk enumeration of psychrotrophic microorganismscolony count technique at 6.5℃》方法检验嗜冷菌数[20]，对不同储存温度和时间的原料乳中嗜冷菌菌数进行测定。

1.3.3乳中微生物生长曲线的测定

每隔一定的时间取出3个平行试样，用0.85%生理盐水分别对3个试样中的牛乳进行适当稀释，使菌浓度控制在103cfu/mL～104cfu/mL，在无菌条件下移取0.1 mL牛乳作平板涂布并测定此时间点的菌数，每个试样做3次平行试验。用平板计数法测定菌落数，数据取3个平行试验的平均值。

1.3.4微生物生长预测模型的建立

初级模型的制作使用SAS软件对微生物数据进行处理，使用Gompertz模型建立初级生长预测模型。

2　结果与分析

由图1、图2和表1相应的生长动力模型可以得出，随着储存温度的升高，总菌数达到最大生长速率的时间逐渐减少，从4℃储存的11.4 h降到14℃储存的9.7 h，达到稳定期的微生物增长量也随着储存温度的升高而增加，从4℃储存的1.76 log10cfu/mL升增加到8℃储存的2.48log10cfu/mL，从10℃储存的1.46 log10cfu/mL升高到14℃储存的1.83 log10cfu/mL。

嗜冷菌菌数达到最大生长速率的时间从4℃储存的15.1 h降到14℃储存的5.4 h，达到稳定期的微生物增长量也随着储存温度的升高而增加，但是在14℃时候出现下降，从4℃储存的1.23 log10cfu/mL增加到12℃储存的1.66 log10cfu/mL。嗜冷菌的最大增长量占总菌落的最大增长量的绝大部分甚至超过，可知在春季低温储存的原料乳中嗜冷菌是生长繁殖的优势菌。

使用Gompertz模型建立的原料乳中总菌生长动力模型的R2﹥0.96，嗜冷菌生长动力模型的R2﹥0.92，表明使用Gompertz模型建立的4℃～14℃储存春季原料乳中总菌和嗜冷菌的生长动力模型是适合的，模型可以有效的模拟春季原料乳中微生物的生长情况。

图1　原料乳在不同储存温度条件下总菌落生长模型Fig.1　The growth model of total colony in the raw milk of spring at different storage temperature conditions

图2　原料乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长模型Fig.2　The growth model of psychrophile in the raw milk of spring at different storage temperature conditions

表1 春季微生物生长模型Table 1　The microbial growth model in spring

表2　总菌落数（x）与嗜冷菌数量（Y）的关系Table 2　The relationship between total colony（x）and psychrophilic（Y）

在较低的储存温度条件下原料乳中嗜冷菌是主要增长的微生物[21-22]。试验表明在4℃～14℃储存条件下的嗜冷菌增长的数目占总菌增长数目的大部分，这与储存条件和嗜冷菌自身的性质有关，在较低的储存温度条件下，嗜温微生物生长缓慢，但是嗜冷菌仍然可以较快地生长。

将试验中获得的总菌数和嗜冷菌数分别取对数，以总菌落数的对数值为x，嗜冷菌数量的对数值为Y，绘制图3。

由图3和表2可以得出，总菌落数随着嗜冷菌的数量增长而增加，呈正相关，在4℃～8℃储存温度下相关系数较高，为0.92，但是10℃～14℃储存温度下相关系数较低，为0.70。

CEMPÍRKOVÁ在1999至2000年的研究表明，原料乳嗜冷菌与菌落总数有相关性，相关性达到0.92[23]，本试验研究结果与CEMPÍRKOVÁ的研究结果相似。可以利用原料乳嗜冷菌与菌落总数有相关性这种关系，根据菌落总数快速推断出嗜冷菌的大致数量。

图3　不同季节总菌落数与嗜冷菌数量的关系Fig.3　The relationship between total colony and psychrophilic in raw milk of different seasons

3　结论

本研究以哈尔滨地区小型奶站的新鲜原料乳为研究对象，春季的原料乳中微生物在不同储存温度下的生长情况和相应指示物的变化情况，使用改进Gompertz模型建立4℃～14℃储存的春季原料乳中总菌落和嗜冷菌的生长动力模型，模型相关系数均大于0.92，可以用来预测微生物生长情况。

研究表明低温储存的春季原料乳中总菌数与嗜冷菌有一定的相关性，在4℃～8℃储存温度下总菌落数与嗜冷菌的数量呈很好的相关性，相关系数为0.92，实际生产中可以通过总菌数推算出嗜冷菌的数量加快检测速度。

参考文献：

[1]Ingram M.Psychrophilic and psychrotrophic microorganisms[J].Annals institute Pasteur Lille,1965,16:111-118

[2]Morita R Y.Psychropphilic bacteria[J].Bacteriology Reviews,1975, 39(2):144-167

[3]D DONALD MUIR.The shelf-life of dairy products:4.Intermediate and long life dairy products[J].InternationalJournal of Dairy Technology,1996,49(4):119-124

[4]Jono N R,Armando C L,Paula S,et al.Monitoring the microbiological quality of raw milk through theuse of an ATP bioluminescence method[J].Food Control,2000,11(4):209-216

[5]Craven H M,Macauley B J.Microorganisms in pasteurised milk after refrigerated storage 1.Identification of types[J].Australian Journal of Dairy Technology,1992,47(1):38-45

[6]吴石金,何光华,万常诘,等.原料乳嗜冷菌分离株微生物学特征研究[J].中国乳品工业,2005,33(8):4-6

[7]HITTU MATTA,V PUNJ.Isolation and identification of lipolytic, psychrotrophic,spore forming bacteria from raw milk[J].International Journal of Dairy Technology,1999,52(2):59-62

[8]Santos M V,Ma Y,Barbano D M.Effect of somatic cell count on proteolysis and lipolysis in pasteurized fluid milk during shelf-life storage[J].Journal of dairy science,2003,86(8):2491-2503

[9]冯可,胡文忠,姜爱丽,等.预测微生物学在鲜切果蔬产品质量安全控制中的应用[J].食品工业科技,2014(10):49-52,56

[10]崔慧玲,陈安均,罗婵,等.鲜切卷心菜中嗜麦芽窄食单胞菌的动力学预测模型[J].食品工业科技,2014(1):150-154,159

[11]刘晓慧,熊蕊,贾月梅,等.金黄色葡萄球菌在菠菜中生长预测模型的建立[J].食品安全质量检测学报,2014,5(5):1495-1500

[12]陈睿,徐幸莲,周光宏.真空包装鸡肉早餐肠货架期预测模型的建立[J].食品科学,2014(6):209-213

[13]张秋勤,徐幸莲.预测微生物学在禽肉质量安全控制中的应用[J].食品科学,2010(13):292-296

[14]邵伟,仇敏,唐明,等.预测微生物学在冷鲜肉货架期预测中的应用[J].肉类工业,2006(11):25-26

[15]郑风荣,陈皓文.2012年和2013年中国海洋微生物学成果分析[J].广西科学院学报,2014(2):134-142

[16]黄潇,蔡颖慧.鱼糕中金黄色葡萄球菌生长预测模型的构建[J].食品科技,2014(7):322-326

[17]邹宇,胡立明,胡文忠,等.单增李斯特菌在牛奶中生长曲线的拟合和预测模型的建立[J].食品工业科技,2014(11):69-73

[18]U Tiwari,D Walsh,L Rivas,et al.Duffy.Modelling the interaction of storage temperature,pH,and water activity on the growth behaviour of Listeria monocytogenes in raw and pasteurised semi-soft rind washed milk cheese during storage following ripening[J].Food Control,2014,42:248-256

[19]刘宏道.GB/T4789.2-2009食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2010

[20]国际乳品联合会.IDF Standard101A.Milk enumeration of psychrotrophic microorganismscolony count technique at 6.5℃[S].瑞士:IDF,2001

[21]Sorhaug T,Stepaniak L.Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products:quality aspects[J].Trends in Food and Science Technology,1997,8(2):35-40

[22]OL’GA B,BARANOVÁ M,LAUKOVÁ A,et al.Hygiene of pasteurized milk depending on psychrotrophic microorganisms[J].Veterinary Institute,2002,46:325-329

[23]CEMPÍRKOVÁ R.Psychrotrophic vs.total bacterial counts in bulk milk samples[J].Veterinary microbiology,2002,47(8):227-233

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.045

收稿日期：2014-08-05

基金项目：黑龙江省科学院预研项目（YY1301）

作者简介：赵金海（1987—），男（汉），工程师，硕士，主要从事微生物方向研究。

*通信作者：段楠（1986—），女（汉），工程师，学士，主要从事食品微生物方向研究。

Application in Low-temperature Storage of Raw Milk of Predictive Microbiology

ZHAO Jin-hai1，DUAN Nan2，*，CHANG Cun1，YAO Hong-bin1，WANG Dong-kai1，WANG Lei1
（1.Heilongjiang Province High Academy of Sciences Institute of Technology，Haerbin 150020，Heilongjiang，China；2.Beianshi Hongxing Farm in Heilongjiang Province，Beian 164022，Heilongjiang，China）

Abstract：With the extensive application of refrigeration equipments，psychrophile and its metabolites，which are themoduric，will be a major factor to affect the quality of raw milk and dairy products.The study points to fresh raw milk as the object and sets up the corresponding Microbial primary growth model by researching total bacteria and psychrophilic of the raw milk at different temperature in spring.Setting up by Gompertz，the growth kinetic model of total colony and psychrophilic in raw milk，which has been stored at between 4℃and 14℃，it can effectively simulate and predict microorganism growth.The study shows that there is a dependability between total colony and psychrophilic in raw milk at low temperature.

Key words：raw milk；Psychrophili；predictive microbiology