液质联用法测定植物油中的4种没食子酸酯

董贵军，乔勇升，李兴根，韩芷玲，胡慧，冯寅洁，陈伟（泰州市产品质量监督检验所，江苏泰州225300）

液质联用法测定植物油中的4种没食子酸酯

董贵军，乔勇升*，李兴根，韩芷玲，胡慧，冯寅洁，陈伟
（泰州市产品质量监督检验所，江苏泰州225300）

摘要：建立了食用植物油中没食子酸酯类化合物测定的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。样品经正己烷饱和的乙睛萃取后，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离，以0.1%甲酸水和甲醇为流动相梯度洗脱，电喷雾电离负离子模式下多反应监测（MRM）模式进行定性、定量检测。4种没食子酸酯类化合物的检出限（S/N=3）为0.02 mg/kg～0.05 mg/kg，定量限（S/N=10）为0.06 mg/kg～0.15 mg/kg；在0.20、0.50、0.80 mg/kg 3个加标水平下回收率为75.4%～91.3%，相对标准偏差小于9.2%。应用建立的方法对市售食用植物油产品进行测定，未发现4种没食子酸酯类化合物。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；没食子酸酯类化合物；食用植物油；没食子酸丙酯；没食子酸异戊酯；没食子酸辛酯；没食子酸月桂酯

没食子酸（gallic acid，GA），化学名3，4，5-三羟基苯甲酸，是可水解鞣质的组成部分，广泛存在于葡萄，茶叶等植物中，是自然界存在的一种多酚类化合物[1]。以没食子酸为原料可以人工合成没食子酸酯类化合物，其脂溶性显著增强，且没食子酸酯类化合物分子中有3个酚羟基处于邻位，是质子的供体，表现出活泼的还原性，具有良好的抗氧化活性[2]和抑菌性能[3]。没食子酸酯类化合物的烷基酯根据烷基碳原子个数可分为低级酯（如甲酯、乙酯、丙酯等）和高级酯（如辛酯、月桂酯等），其中没食子酸丙酯是（Propyl gallate，简称PG）常作为抗氧化剂应用于食品工业。虽然没食子酸丙酯的毒性被认为低于丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）与特丁基对苯二酚（TBHQ）[4]，但仍有报道称没食子酸酯这类人工合成抗氧化剂的过量使用仍会对人体健康造成危害，如过敏性炎症[5]等。

人工合成食品添加剂的使用安全性越来越受到关注，对其使用量也有严格的规定。我国的食品添加剂使用标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[6]规定没食子酸丙酯在脂肪和油、熟制坚果与籽类、油炸和方便米面制品、饼干、腌腊肉制品类、干制水产品、鸡肉粉和膨化食品中的最大使用量不得超过0.1 g/kg、胶基糖果中不得超过0.4 g/kg。而没食子酸异戊酯（Isoamyl Gallate，简称IAG）、没食子酸辛酯（Octyl gallate，简称OG）、没食子酸月桂酯（Dodecyl gallate，简称DG）未被GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》确认为允许使用的食品添加剂品种。

没食子酸酯类化合物检测常用的方法有分光光度计法[7]、液相色谱法[8-11]、毛细管电泳法[12]。国家标准主要采用分光光度计法[13]和液相色谱法[14-15]对PG进行检测。本文建立了超高效液相色谱-质谱法对食用植物油中没食子酸酯类化合物进行定性定量分析的检测方法，快速简便，准确灵敏，为没食子酸酯类化合物的检测提供了有利工具。

1　试验部分

1.1仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪、Waters Micromass Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪、Mass-Lynx V4.1数据处理操作平台：美国Waters公司；Millipore纯水系统，配有Milli-Q Academic超纯水器和RiOs反渗透水纯化系统：美国Millipore公司；Sartorius CP225D型电子分析天平，感量为0.000 01 g：德国Sartorius公司。

G（纯度≥99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；IAG（纯度≥98.5%）、OG（纯度≥98.5%）：东京化成工业株式会社；DG（纯度≥99.0%）：美国Fluka公司；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC级）：迪马科技有限公司；甲酸（分析纯）：国药集团药业股份有限公司；试验用水均为超纯水：Millipore公司超纯水系统制备，电阻率为18.2 MΩ·cm；Acrodisc GHP双性滤膜（0.2 μm）：美国PALL公司；氮气、氦气（纯度>99.999%）：南京特种气体厂有限公司。

没食子酸酯标准溶液：各自称取没食子酸酯标准品适量，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至50 mL，配成1.0 g/L的标准储备溶液，置于4℃冰箱避光保存。使用时根据需要用空白样品提取液配制成适当质量浓度的标准溶液。

1.2仪器工作条件

液相色谱条件：WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱（2.1mm×50 mm，1.7μm）；柱温30℃；流量0.3mL/min；进样量10 μL；流动相A为0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0 min～1.0 min，B 为28%；1.0 min～1.4min，B由28%升至70%；1.4 min～1.9 min，B由70%升至90%；保持0.9 min；2.8 min～2.9 min，B由90%降至28%；保持1 min。

质谱条件：电喷雾负离子源ESI（-），离子源温度120℃，毛细管电压3.0 kV，RF透镜电压0.5 V，脱溶剂温度300℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h，多反应监测模式（MRM），其他参数见表1。

表1　4种没食子酸酯的质谱采集参数Table 1　UPLC-MS/MS acquisition parameters for the 4 gallates

1.3试验方法

准确称取植物油样品2 g（精确至0.000 1 g）于具塞离心管中，加人5 mL乙睛饱和的正己烷，漩涡混合3 min～5 min以充分溶解油样，加人10 mL正己烷饱和的乙睛，漩涡混合3 min～5 min，静置分层，用胶头吸管将乙睛层转人浓缩瓶内。重复以上操作再用乙睛提取两次，合并乙睛提取液于锥形瓶内。将乙睛提取液在40℃下，旋转蒸发浓缩至近干，初始流动相定容至2 mL，0.22 μm滤膜过滤后备用。

2　结果与讨论

2.1质谱条件

没食子酸酯类化合物的结构见图1。

图1　没食子酸酯类化合物的结构图Fig.1　Structure of gallates

如图1所示，PG、IAG、OG、DG的分子结构中都含有3个羟基，呈弱酸性，适合在ESI的负离子模式下形成准分子离子。以[M-H]-作为母离子，进行子离子扫描，确定丰度最高的两个子离子作为定性、定量特征离子。对毛细管电压、锥孔电压、射频透镜电压、碰撞能量等质谱参数进行优化，4种没食子酸酯的定量和定性子离子及相应的质谱参数见表1。

本文考察了4种没食子酸酯在纯水、甲醇、0.1%甲酸、氢氧化铵（pH8.0）4种溶液作为流动相时的电喷雾电离情况。结果发现，PG、DG、OG、IAG在中性环境（纯水、甲醇）和酸性环境（0.1%甲酸溶液）中均能电离、且信号良好，在碱性环境（氢氧化铵溶液）中信号最强。

2.2没食子酸酯的碰撞诱导解离分析

如图1所示，PG、IAG、OG、DG的化学结构相似，其苯环上都含有3个羟基，在负离子模式下均失去1 个H离子生成[M-H]-。以[M-H]-为母离子进行碰撞诱导解离分析。4种没食子酸酯都产生了m/z为124.1和169.1的碎片子离子。推测PG裂解途径如图2所示。

图2没食子酸丙酯（PG）可能的ESI-MS裂解途径Fig.2　Proposed fragmentation pathways of propyl gallate in ESI-MS

IAG、OG、DG在质谱中的裂解规律很有可能与PG类似。

2.3色谱条件

由于4种没食子酸酯的母离子 [M-H]-经过碰撞诱导解离后产生的两个丰度最高的子离子都为m/z 169.1和m/z124.1，为避免干扰，通过液相色谱将4种没食子酸酯尽量分离。结合没食子酸酯的理化性质及其在色谱柱的分配特性，分别选用基于1.7 μm小颗粒填料技术的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱和ACQUITY UPLC BHE C18色谱柱对没食子酸酯进行色谱分离。结果显示，优化条件下4种没食子酸酯在AC QUITY UPLC HSS T3色谱柱能获得更好的色谱分离效果。

试验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L甲酸铵溶液、甲醇-氢氧化铵（pH8.0）溶液4种流动相在液质联用检测中的分离效果。结果表明，含有少量酸的流动相体系可以使没食子酸酯在色谱柱上获得理想的分离效果。综合考虑没食子酸酯在4种流动相体系中的色谱分离效果和质谱检测情况，选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为没食子酸酯液质联用检测的流动相。

2.4工作曲线和检出限

按本试验方法，对50、100、200、500、1 000 μg/L没食子酸酯混合标准溶液进行测定。以定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，没食子酸酯的质量浓度为横坐标，绘制工作曲线。采用在空白油脂样品中添加没食子酸酯标准品的方法，设定目标物质定量离子色谱峰的检出限（LOD）为S/N=3，定量限（LQD）为S/N=10。4种没食子酸酯的线性方程、检出限和定量限见表2。

表2　4种没食子酸酯的线性范围、回归方程、相关系数（R）2、检出限和定量限Table 2　Linear range，regression equation，correlation coefficient （R2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the 4 gallates

2.5回收率与精密度

为检验方法的真实度，采用经测定不含没食子酸酯的花生油样品作为空白基质进行添加回收率和精密度试验，样品添加标准溶液使没食子酸酯的含量分别为0.20、0.50、0.80 mg/kg，按照1.3制备方法进行处理，1.2仪器条件进行测定，重复测试6次，回收率及精密度结果见表3。

表3　花生油中4种没食子酸酯的添加回收率和精密度测试结果（n=6）Table 3　Results of recovery and precision for 4 gallates in peanut oil（n=6）

在做标准添加时，由于甲醇配制的标准储备液与油脂样品不能完全混溶，可使用丙酮稀释标准储备液配制成标准工作液后进行添加。空白样品中添加没食子酸酯（0.50 mg/kg）获得的多反应监测色谱图见图3。

图3　空白油脂样品及加标油脂样品的总离子流色谱图Fig.3　Total ion current chromatograms of a blank oil sample and an oil sample spiked with 0.50 mg/kg of the standard

2.6样品测定

为验证该方法的可靠性，从超市购买了10种食用植物油产品（包括大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油、玉米油）进行测定，同时作质控样品。结果显示，所抽取的样品中均未检出没食子酸酯残留，质控样品的回收率等指标均达到分析要求。

3　结论

建立了一种使用超高效液相色谱-串联质谱测定食用植物油中4种没食子酸酯的方法。该方法快速简便、灵敏度高、重现性好，为食用植物油中没食子酸酯的定性与定量分析提供了实用的技术手段。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.039

收稿日期：2014-04-18

作者简介：董贵军（1984—），男（汉），助理工程师，本科，研究方向：食品安全检测。

*通信作者：乔勇升（1980—），男（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：食品安全检测。

Determination of Gallates in Vegetable Oil by UPLC-MS/MS

DONG Gui-jun，QIAO Yong-sheng*，LI Xing-gen，HAN Zhi-ling，HU Hui，FENG Yin-jie，CHEN Wei
（Taizhou Institute of Supervision&Testing on Product Quality，Taizhou 225300，Jiangsu，China）

Abstract：A method was established for the determination of gallates in edible vegetable oil based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The oil sample was extracted by hexane-saturated acetonitrile，and the chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLCTM HSS T3 column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）by gradient elution with 0.1%formic acid solution and methanol as the mobile phase.The analyte was detected by electrospray ionization in negative ion mode-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM）mode.For the four gallates，the limits of detection（LOD）were from 0.02 mg/kg to 0.05 mg/kg and the limits of quantification（LOQ）were from 0.06 mg/kg to 0.15 mg/kg.The average recoveries were ranged from 75.4%to 91.3%at the spiked levels of 0.20，0.50，0.80 mg/kg，with the relative standard deviations（RSDs）were not more than 9.2%.Some edible vegetable oil products from local market were detected by the developed method，and the four gallates were not found.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；gallates；edible vegetable oil；propyl gallate；isoamyl gallate；octyl gallate；dodecyl gallate