竹根七中白桦脂醇的分离与含量测定

寇智斌，夏晓慧，陆遥，何林林，林奇泗（徐州医学院药学院，江苏徐州221004）

竹根七中白桦脂醇的分离与含量测定

寇智斌，夏晓慧，陆遥，何林林，林奇泗*
（徐州医学院药学院，江苏徐州221004）

摘要：以植物竹根七根及根茎为原料，从中分离并检测天然防腐成分。用系统溶剂法从竹根七中分离得到化合物纯品，用核磁法测定其结构，用高效液相法测定其含量。所得化合物为白桦脂醇，其含量为（0.28±0.02）mg/g。竹根七中含有天然防腐成分白桦脂醇。

关键词：竹根七；白桦脂醇；高效液相

天然药物竹根七（Tupistra chinensis Bak.）为百合科开口箭属植物，分布于中国陕西、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、云南等地，生于林下阴湿处、溪边或路旁。竹根七以根状茎入药，其味甘、微苦，有小毒，具有清热解毒，散瘀止痛的功效。常用于治疗白喉，风湿关节痛，腰腿疼；外用治痈疖肿毒[1-2]。竹根七具有多方面药理活性，其醇提物具有祛痰、抗炎及抑菌作用[3]。经现代研究发现，竹根七提取物在体内外试验中均表现出较强的抗肿瘤和抗菌活性[4]。竹根七的抗肿瘤和抗菌活性成分主要是其酸性多糖和总皂苷[5-7]。

本研究组在对其进行活性研究时发现，竹根七中总酚酸的抗氧化和抗菌活性最强[8]。本研究组采用系统提取法对竹根七进行成分提取，用核磁及液相方法确定其结构，以期明确其作用机理和物质基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

AV-600核磁共振仪：瑞士Bruker公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ZF-1三用紫外分析仪：上海精科实业有限公司；HZQ-C双层水浴振荡器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；Agilent 1260型高效液相色仪：安捷伦Agilent。

1.1.2试剂与药材

石油醚（60℃～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇：购自科特试剂有限公司；薄层层析硅胶GF254柱层析硅胶（100目～200目）、柱层析硅胶（200目～300目）、Sephadex LH-20、D101大孔树脂：购自青岛海洋化工有限公司。

竹根七药材（批号90043）：购自鹏翔药业，粉碎并过二号筛后贮于干燥器备用；对照品白桦脂醇（批号130914）：购自四川省维克奇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1提取与分离

将药材粗粉5 kg，加入10倍量75%乙醇浸泡过夜，采用中药提取罐进行回流提取，提取3次，提取时间依次为2、1.5 h和1.5 h，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得浸膏，将浸膏用适量水稀释悬浮后，依次先后用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取5次，合并各萃取液，减压浓缩后得到4个萃取层的浸膏。

将乙酸乙酯浸膏用硅胶拌样后，采用硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇溶剂系统不同梯度（100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20，体积比）进行洗脱。将洗脱后得到的馏分通过TLC检查合并相近组分。在氯仿-甲醇（95∶5，体积比）的梯度洗脱出馏分，经过反复硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离和纯化，得到某白色结晶。

1.2.2核磁共振测定结构

将1.2.1项下分离得到的白色结晶进行1H NMR spectra和13C NMR核磁分析。所得白色结晶溶解于吡啶中，在300 MHz下分析，以四甲基硅烷（TMS）为标准对照品计算各峰的化学位移δ（mg/L）。

1.2.3HPLC分析

1.2.3.1色谱条件与系统试用性试验

Agilent 1260型高效液相色仪；色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（4.6ID×250 mm）Manf.No.K66428；流动相：甲醇-0.1%甲酸（85∶15，体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL；检测波长：210 nm。按上述色谱条件进样，白桦脂醇与相邻峰的分离度皆大于1.5，理论板数按白桦脂酸峰和白桦脂醇峰皆大于3 000。

1.2.3.2供试品溶液的配制

精密称取干燥的竹根七粗粉5 g，以甲醇为提取溶剂，于索氏提器中水浴恒温85℃提取3次，每次60min。滤过，合并3次滤液于旋转蒸发器上旋转蒸发将其浓缩近干。将浓缩后样品用甲醇溶解滤过后转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.2.3.3对照品溶液配制

称取白桦脂醇对照品适量，用甲醇溶解于50 mL容量瓶中定容至刻度，精密配制浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL白桦脂醇对照品溶液。

1.2.3.4高效液相色谱分析

取1.2.3.3项下一系列不同浓度的白桦脂醇对照品溶液按1.2.3.1项下色谱方法分析，计算回归方程。再取1.2.3.2项下供试品溶液按1.2.3.1项下色谱方法分析，计算含量，测定3次，求平均值及RSD值。

2　结果与讨论

2.1结构鉴定

将1.2.1项下分离得到的白色结晶进行核磁氢谱和碳谱的分析，得到结果如下：白色结晶，1HNMR（吡啶，300 MHz）0.815（3H，s），0.845（3H，s），1.043（6H，s），1.052（3H，s），1.056（3H，s），1.787（3H，s），3.533（1H，dd，11.4，4.2 Hz），4.754（1H，s），4.964（1H，s）；13CNMR（吡啶，300 MHz），150.245（C-20），109.964（C-29），78.153（C-3），56.655（C-17），51.011（C-9），49.823 （C-19），47.841（C-18），42.883（C-14），41.156（C-8），39.547（C-4），38.692（C-13），37.561（C-10），34.872（C-7），32.931（C-16），28.672（C-23），28.333（C-2），21.234（C-11），19.502（C-30），16.365（C-26）与文献[9]报道一致，故确定该化合物为白桦脂醇（Betulin），分子结构见图1，该化合物为首次从竹根七中分离得到。

图1　白桦脂醇分子结构图Fig.1　Molecular structure of Betulin

2.2样品含量测定

按1.2.3.3项下对照品溶液，分别进样测定。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y= 6 434.1X+85.25，r=0.999 3。取1.2.3.2项下供试品溶液3份，按1.2.3.1项下色谱条件进样分析，色谱图见图2。将峰面积代入回归方程求得竹根七中白桦脂醇平均含量为0.28 mg/g，RSD为1.7%。

3　结论

白桦脂醇及其衍生物作为生物制剂广泛应用于食品、药品和化妆品行业。其在食品开发领域可作为一种天然的新型防腐剂用于肉制品的防腐。据文献报道，以牛肉为原料，使用白桦脂醇作为天然的新型防腐剂可得到货架期和感官性质俱佳的牛肉干产品[10]。白桦脂醇多从白桦树皮中提取，在其他植物中也有少量存在。然而白桦树是多年生木本植物，采收其树皮对森林植被的破坏较大。如果能够广泛的发掘含有白桦脂醇的天然植物，尤其是生长周期短的草本植物，必将产生的良好的社会和经济效益。目前在竹根七中发现白桦脂醇尚属首次。竹根七甲醇提取物对细菌的抑制作用也印证了其作为天然防腐成分来源的可行性。本研究为天然防腐剂植物来源的扩大提供了试验基础。

图2　竹根七提取物高效液相色谱图Fig.2　HPLC chromatograms of the reference substance and extracts from Tupistra chinensis

参考文献：

[1]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴:第5册[M].北京:科学出版社,1985:496

[2]李青,邹坤,汪鋆植.开口箭提取物细胞毒活性研究[J].时珍国医国药,2007,18(7):1594-1595

[3]杨春艳,杨兴海,刘英,等.开口箭祛痰、抗炎及抑菌实验研究[J].中国民族民间医药杂志,2005(2):103-106

[4] 朱正光,余传林,蔡晶,等.开口箭提取物的抗肿瘤作用研究[J].中药材,2006,29(3):277-279

[5]解燕,朱正光,余传林.开口箭酸性多糖对小鼠免疫功能的调节作用及抗肿瘤作用的初步研究[J].中药材,2010,33(4):596-599

[6]蔡晶,雷林生,朱正光,等.开口箭皂苷对人神经胶质瘤细胞作用及相关机制研究[J].时珍国医国药,2008,19(3):693-695

[7]蔡晶,朱正光,余传林,等.开口箭皂甙抑制小鼠S-180肉瘤细胞增殖及实体瘤生长的实验研究[J].南方医科大学学报,2006,27 (2):188-190,196

[8]Qisi Lin,Miao Wang,Jinghua Li,et al.Analysis of fatty acids, aliphatic esters,and in vitro studies of antioxidant and antimicrobial activities for Recineckea carnea and Tupistra chinensis from the Guizhou province[J].Journal of Medicinal Food,2013,17(2):236-243

[9]陈凤凰,唐文明.核桃树皮的化学成分分析及活性研究[J].天然产物研究与开发,2008,20(1):16-18

[10]袁秋萍,陈劼,倪婷婷.白桦脂醇在肉制品中的应用研究[J].食品工业,2013,34(11):78-80

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.033

收稿日期：2015-08-31

基金项目：徐州市科技厅2014年立项课题（Xjy201419）

作者简介：寇智斌（1987—），女（汉），药师，本科，研究方向：药物体内代谢研究。

*通信作者：林奇泗（1980—），男（汉），副教授，博士，研究方向：中药活性成分分析与体内代谢研究。

Isolation and Determination of Betulin in Tupistra chinensis

KOU Zhi-bin，XIA Xiao-hui，LU Yao，HE Lin-lin，LIN Qi-si*
（College of Pharmacy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，Jiangsu，China）

Abstract：The natural preservatives composition of roots and rhizomes of Tupistra chinensis was separated and detected.The systematic solvent extraction method was used to isolate active ingredients.Structure of isolated compound was identified by nuclear magnetic，and its content was determined by HPLC.The isolated compound was identified as Betulin，and its content was（0.28±0.02）mg/g.Betulin which is a kind of natural ingredient exists in Tupistra chinensis.

Key words：Tupistra chinensis；Betulin；HPLC