GPC净化-GC-MS法测定烤鳗中硫丹及其代谢物残留

刘海燕，吕蓉，凌晶，刘针铃，左海根，郭平（江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江西南昌330000）

GPC净化-GC-MS法测定烤鳗中硫丹及其代谢物残留

刘海燕，吕蓉，凌晶，刘针铃，左海根，郭平
（江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江西南昌330000）

摘要：建立了烤鳗中α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯残留的GPC净化-GC/MS检测方法。样品经丙酮等溶剂提取，凝胶渗透色谱（GPC）净化，GC-MS（NCI）检测和确证。α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯混合标准溶液的质量浓度在0.5 g/L～20 g/L范围内线性关系良好，在烤鳗中不同质量浓度水平的加标平均回收率为76.9%～86.6%，相对标准偏差（RSD=6）为4.6%～7.6%，检出限（S/N=3）为0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

关键词：凝胶渗透色谱（GPC）；气相色谱-质谱（GC-MS）；硫丹；硫丹硫酸酯；烤鳗

硫丹（endosulfan）是一种高毒有机氯杀虫剂，常被广泛应用于很多农作物上，但它的危害性极高，对生殖系统等有损伤和诱变作用[1]。由于农业上的不合理使用及雨水淋溶，硫丹进入环境后具有较高的持久性，其在植物和土壤中氧化并主要形成的硫丹硫酸酯代谢物与母体化合物毒性相当，在环境中的半衰期更长，对环境构成巨大威胁[2]。由于硫丹具有持久性污染、高毒性、生物富集性等特点，已经成为一个极具争议的农药，目前在50多个国家被禁止使用，包括美国、新西兰、澳大利亚、欧盟、一些亚洲和西非国家。2010年10月，硫丹被纳入斯德哥尔摩公约持久有机污染物附件A中，禁止在全球使用和制造。我国烤鳗出口对象国主要集中在日本、韩国，硫丹是日本高度关注的监控项目之一，已被实行命令检查。日本在2006年5月实施的《食品残留农业化学品肯定列表制度》（简称“肯定列表制度”）中规定水产品中硫丹最大残留量为0.004 mg/kg。为了保障出口产品的质量，国家质量监督检验检疫局总局也将水产品的硫丹列为重点监控项目之一。

目前，硫丹残留量测定方法有气相色谱法-电子捕获法[3-5]、气相色谱-质谱法[6-7]。大多数采用弗罗里硅土等固相萃取柱净化。烤鳗基质较为复杂，富含大量的蛋白质、脂类化合物等，而且残留物浓度很低，样品的净化至关重要，样品处理不当，会对农残分析产生严重干扰。凝胶渗透色谱（GPC）是在农药残留分析中使用较多的前处理净化方法，尤其对动物脂肪、牛奶、食用油等富含油脂、蛋白质、色素的样品净化效果好[8]，GPC能有效去除烤鳗样品中的的蛋白质及脂类等大分子干扰物。GPC净化-GC/MS法测定烤鳗中的硫丹及其代谢物残留检测方法国内鲜见报道。该方法灵敏、准确、高效，最低检出限（S/N=3）达到0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，可满足烤鳗中硫丹及代谢物残留的检测要求。

1　材料与方法

1.1仪器与设备

Agilent 6890气相色谱仪、Agilent 5975B质谱仪-配备NCI负化学离子源：Agilent公司；Ultra全自动预浓缩-GPC净化-定量浓缩系统：德国LC Tech公司；IKA ULTRA-TURRAX T25均质器：德国IKA公司；R-215旋转真空蒸发装置：瑞士BUCHI公司；N-EVAP-24氮吹浓缩仪：美国Organomation公司；SHZ-C水浴恒温振荡器：金坛市鑫鑫实验仪器有限公司；ELGA PURE LAB ULTRA MK2超纯水一体机：法国威立雅公司；VORTEX GENIE2漩涡混合器：SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BSA2202S电子天平：德国Sartorius公司。

1.2材料与试剂

烤鳗来自于国家质量监督检验检疫局总局残留监控计划抽样。

丙酮、石油醚（沸程30℃～60℃）、正己烷、环己烷、乙酸乙酯（均为色谱纯）：德国CNW公司；氯化钠：国药集团化学试剂有限公司；3种标准品：α-硫丹（alpha-Endosulfan）、β-硫丹（beta-Endosulfan）及硫丹硫酸酯（Endosulfan sulfate）（纯度≥99.0%）：德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

分别准确称取3种农药标准品0.010 0g，用少量丙酮溶解后，用正己烷定容至100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL标准储备液。取一定体积的每种农药标准储备液，用正己烷稀释成1 μg/mL的混合标准工作溶液，4℃冰箱保存，可使用1个月。检测前加入正己烷梯度配制成质量浓度分别为20、10、5、2、1、0.5 μg/L的基质标准系列。

1.3.2样品前处理

取烤鳗可食部分，用组织捣碎机充分捣碎均匀。称取20.00 g试样（精确至0.01 g）于250 mL具塞三角瓶中，加超纯水6 mL，准确加入丙酮40 mL，以转速15 000 r/min均质1 min，加入6 g氯化钠，充分摇匀，再加30 mL石油醚，振荡30 min。准确吸取35 mL有机层上清液于平底烧瓶中，旋蒸浓缩至约1 mL，加5 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）于平底烧瓶中再浓缩，重复两次，浓缩液转移至加25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）定容至刻度，摇匀。通过0.22 μm的有机系滤膜后，转移至凝全自动预浓缩-GPC净化-定量浓缩系统上净化，采用GC-MS（NCI）法检测和确证。

1.3.3色谱条件

凝胶渗透色谱（GPC）条件：凝胶色谱柱（320 mm× 25 mm）；Bio-Beads S-X3作为柱填料；流动相为环己烷-乙酸乙酯（1∶1，体积比）；流速：5 mL/min；进样体积：5.0 mL；收集时间段：1 080 s～1 800 s；浓缩温度：40℃；定容体积：2 mL。

气相色谱（GC）条件：Agilent DB-1701石英毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温条件：50℃保持2 min，以30℃/min速率升至130℃，以10℃/min速率升至260℃，保持5 min，总运行时间22.67 min；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气（纯度≥99.999%）；流速：1.3 mL/min；不分流进样，0.75 min后开阀；进样量：1.0 μL；溶剂延迟5 min。

质谱（MS）条件：负化学离子源（NCI）；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；反应气：甲烷气；选择离子监测方式 SIM；α-硫丹、β-硫丹监测离子 m/z为404，406，408，410，定量离子m/z为406；硫丹硫酸酯监测离子m/z为384、386、388、390，定量离子m/z为386。

2　结果与分析

2.1净化条件的确定

2.1.1净化方式的选择

除去油脂是非常关键的步骤，通常采用超低温冷冻除脂[9-10]、固相萃取（SPE）柱[11-14]和凝胶渗透色谱（GPC）净化[15-17]。本试验考察了-18℃冷冻除脂联合C18固相萃取柱（C18SPE，1 g/6 mL）、石墨化碳黑固相萃取柱（GCB SPE，500 mg/3 mL）串联中性氧化铝固相萃取柱（Al2O3SPE，1.0 g/3 mL）、GPC净化这3种净化方式对烤鳗加标样品净化的除油效果和回收率情况。结果：GPC净化效果最好，洗脱液中基本没有油脂，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯回收率均达70%以上；-18℃冷冻除脂联合C18SPE柱净化回收率仅有35%，原因可能为在-18℃冷冻下去除大部分油脂时，一同去除了部分目标化合物；GCB SPE柱串联Al2O3SPE柱除油效果差，洗脱液中仍含有大量的油脂，检测时对色谱柱损害大、响应骤降。

2.1.2GPC净化的条件优化

本试验将添加100 μg/L的烤鳗样品提取液，过GPC净化，通过收集GPC不同时间段的流出液，观察其含油量的变化及用GC-MS分析含量。试验结果表明，烤鳗提取液中的蛋白质及脂类等大分子干扰物基本流出的时间为1 080 s，目标物集中在1 080 s～1 800 s流出，目标物流出曲线见图1。

图1　硫丹及硫丹硫酸酯在GPC条件下的回收率Fig.1　Recoveries of endosulfan and endosulfan sulfate by GPC

因此，本试验最终选用GPC净化烤鳗提取液，收集1 080 s～1 800 s流出液。

2.2检测方式的选择

硫丹是全球禁止使用的药物，日本在“肯定列表制度”中规定水产品中硫丹最大残留量为0.004 mg/kg，检测对仪器的灵敏度要求较高。考虑到硫丹及其代谢物具有很强的电负性，GC-MS（NCI）对该物质具有很高的灵敏度，且质谱法为确证方法，对结果的判断优于气相法。本试验采用烤鳗样品进行添加回收试验，样品经处理后用GC-MS（NCI）测定，回收率均达到70%以上，标准、经GPC净化的加标（10 μg/kg）烤鳗样品及空白烤鳗样品色谱图如图2所示。

图2　标准、经GPC净化的加标（5 μg/kg）烤鳗样品及空白烤鳗样品色谱图Fig.2　Chromatogram of standard，spiked eel sample（5 μg/kg）with GPC purification and blank eel sample

从谱图可看出基质中不含有硫丹和硫丹硫酸酯，无干扰成分存在。因此本试验采用GC-MS（NCI）检测和确证。

2.3线性范围和检出限

在最佳试验条件下，取一系列不同质量浓度的α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯标准混合溶液，以仪器响应峰面积对混合标准的质量浓度作标准曲线。结果显示，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的质量浓度在0.5 μg/L～2 μg/L范围内线性关系良好，各组分的线性范围、线性回归方程及相关系数见表1。

表1　回归方程、线性范围、相关系数和检出限Table 1　Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and detection limits

根据3倍信噪比测得3种分析物的检出限为0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

2.4回收率和精密度

在不含农药的烤鳗样品中分别添加低、中、高3个水平的3种农药混合标准工作溶液，平行测定6次，结果，3种分析物的平均回收率为76.9%～86.6%，相对标准偏差为4.6%～7.6%，具体结果如表2所示。

表2　3种农药在烤鳗中的添加回收率和精密度（n=6）Table 2　Recoveries and precision of 3 pesticides in eel（n=6）

2.5实际样品分析

应用所建立的GPC净化-GC-MS法检测了2014年国家质检总局残留监控计划中规定的烤鳗中硫丹及其代谢物的残留，共检测88批次烤鳗样品进行检测，硫丹（以α-硫丹、β-硫丹及硫丹代谢物硫丹硫酸酯总量计）检出率达17.9%，其中残留量最高达0.025 mg/kg，主要检出为硫丹硫酸酯残留超标，超过了日本“肯定列表制度”规定的鳗鱼中硫丹最大残留限量0.004 mg/kg的要求。

3　结论

本文建立了应用GPC净化-GC/MS法测定烤鳗中硫丹及其代谢物残留的方法。样品经丙酮等提取，凝胶渗透色谱净化，GC/MS检测和确证，外标法定量。通过大量烤鳗样品试验验证，α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯的线性关系良好，在烤鳗中不同质量浓度水平的加标平均回收率为76.9%～86.6%，相对标准偏差（RSD=6）为4.6%～7.6%，方法的检出限（S/N=3）为0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，该方法具有高效、定性准确、灵敏度高等特点，可满足烤鳗中硫丹及代谢物残留的检测限量要求。

硫丹残留在水产品中的高检出率，可能是由于水源受硫丹污染，硫丹在水中很快被污泥和水生生物吸附，继而造成养殖环境污染和水产品中的残留超标。硫丹残留问题应引起水产品养殖管理部门及相关企业的重视。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.031

收稿日期：2014-12-29

基金项目：江西省青年科学基金项目（20142BAB213028）

作者简介：刘海燕（1984—），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事食品质量安全检测工作。

Determination of Endosulfan and Its Metabolites Residues in Roasted Eel by GC/MS with GPC Purification

LIU Hai-yan，LÜ Rong，LING Jing，LIU Zhen-ling，ZUO Hai-gen，GUO Ping
（Technical Center of Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanchang 330000，Jiangxi，China）

Abstract：An analytical method for the determination of alpha-Endosulfan，beta-Endosulfan and Endosulfan sulfate residues in Roasted Eel by GPC-GC/MS.Samples were extracted with acetone and other solvents，purified by GPC，then determined by GC-MS（NCI）.Good linear relationships were obtained between the peak areas and the concentrations of alpha endosulfan，beta-endosulfan and endosulfan sulfate within the range of 0.5 g/L-20 g/L.The recovery of standard addition of pesticides in different concentration levels in roasted eel rate respectively were 76.9%-86.6%，relative standard deviation（RSD=6）was 4.6%-7.6%.Method detection limit（S/N=3）was 0.01 μg/kg-0.03 μg/kg.

Key words：gel permeation chromatography（GPC）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；endosulfan；endosulfan sulfate；roasted eel