昆虫内生真菌Alternariasp.次级代谢产物研究

张清清 郭玲芝 陈剑锋 邹 坤 郭志勇

（三峡大学 生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002）

昆虫内生菌因其宿主的特殊环境，已经证明可以产生骨架新颖的活性次级代谢产物，因而昆虫内生真菌正成为天然产物新的源泉［1－3］.本实验室对神农架地区的几株昆虫内生菌Alternariasp.、Paraconiothyriumbrasiliense、Penicilliumoxalicum等的次级代谢产物进行了初步研究，分离得到一系列环肽类、呋喃酮类、聚酮类等化合物，并测定了它们的药理活性［4－7］.

本文继续对采自神农架地区的粉蝶科菜粉蝶（PierisrapaeLinne）的内生真菌Alternariasp.的次级代谢产物进行研究，通过各种色谱技术和现代波谱技术分离并鉴定了4个化合物，确定为4个混源萜类化合物，并测定了这4个化合物的酪氨酸激酶的抑制活性.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

X Series 2质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific；Ultimate 3000型DIONEX高效液相色谱仪，美国DIONEX；高压灭菌器，上海巴玖实业有限公司；Ultrashied TM 400MHZ型核磁共振仪，瑞士Bruker；显微熔点仪（未校正），天津市分析仪器厂.培养基的配制见参考文献［4］.

1.2 菌种的分离、纯化及鉴定

菌株分离方法见文献［4］，菌株由三峡大学微生物学博士涂璇副教授鉴定.

1.3 菌种的发酵

保藏菌株接种至PDA平皿，培养8d，转移至PDB培养基中为种子液，继续培养5d，后接入SDB液体培养基中，100瓶，摇床160r／min，恒温28℃培养20d.

1.4 代谢产物的提取与分离

发酵结束，分离发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，浓缩得浸膏10.2g，以硅胶柱层析分离，流动相：氯仿－甲醇，梯度洗脱，得7个馏分段（Ⅰ－Ⅶ）.Ⅶ中的馏分经 HPLC制备（乙腈－水40%∶60%，v∶v）得到化合物1（6mg）、2（5mg）、3（7mg）和4（10mg）.

图1 化合物1－4的结构

2 化合物的结构鉴定

化合物1：黄色油状物，分子式：C21H30O4，ESIMS m／z：347［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：3.97（s，H－1a），3.92（s，H－1b），1.61（s，H－2′），5.21（t，J＝7.0Hz，H－3），2.00（m，H－4a），1.91（m，H－4b），1.36（m，H－5），1.90（s，H－6），0.97（s，H－6′），5.30（brs，H－8），2.46（m，H－9a），2.62（m，H－9b），1.42（s，H－10′），2.82（m，H－11），2.16（m，H－12a），2.69（m，H－12b），4.36（m，H－15），1.94（m，H－16a），2.22（m，H－16b），2.26（m，H－17a），2.62（m，H－17b）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：68.8（C－1），135.3（C－2），13.7（C－2′），125.0（C－3），24.9（C－4），34.7（C－5），30.9（C－6），19.8（C－6′），150.0（C－7），119.7（C－8），45.2（C－9），89.4（C－10），23.6（C－10′），47.1（C－11），14.9（C－12），107.9（C－13），170.7（C－14），66.7（C－15），28.8（C－16），33.6（C－17），197.0（C－18）；以上波谱数据，参照文献［8］，基本一致，确定该化合物为Tricycloalternarene 2a.

化合物2：黄色油状物，分子式：C21H30O4，ESI－MS m／z：347［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：3.98（s，H－1a），3.95（s，H－1b），1.61（s，H－2′），5.23（t，J＝7.0Hz，H－3），2.03（m，H－4a），1.98（m，H－4b），1.48（m，H－5a），1.32（m，H－5b），2.20（s，H－6），0.97（s，H－6′），5.32（br s，H－8），2.43（m，H－9a），2.58（m，H－9b），1.44（s，H－10′），2.79（m，H－11），2.16（m，H－12a），2.73（m，H－12b），2.36（m，H－15a），2.52（m，H－15b），1.74（m，H－16a），2.29（m，H－16b），4.02（m，H－17）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：68.8（C－1），135.3（C－2），13.7（C－2′），125.4（C－3），24.9（C－4），34.7（C－5），31.1（C－6），20.2（C－6′），150.0（C－7），119.9（C－8），45.1（C－9），88.8（C－10），23.2（C－10′），46.5（C－11），14.9（C－12），105.1（C－13），172.9（C－14），27.8（C－15），29.5（C－16），71.0（C－17），197.7（C－18）；以上波谱数据，参照文献［9］，基本一致，确定该化合物为Tricycloalternarene 2b.

化合物3：黄色油状物，分子式：C21H30O3，ESIMS m／z：331［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：1.63（s，H－1），1.54（s，H－2′），5.03（t，J＝7.0Hz，H－3），1.8l（m，H－4），1.28（m，H－5），1.90（m，H－6），0.95（d，H－6′），5.35（br s，H－8），2.43（m，H－9a），2.58（m，H－9b），1.44（s，H－10′），2.55（m，H－12），4.29（m，H－15），1.93（m，H－16a），2.17（m，H－16b），2.53（m，H－17）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：25.7（C－1），131.6（C－2），17.7（C－2′），124.5（C－3），25.9（C－4），34.9（C－5），32.3（C－6），20.2（C－6′），151.0（C－7），119.8（C－8），44.9（C－9），88.5（C－10），23.7（C－10′），46.6（C－11），15.3（C－12），108.1（C－13），171.3（C－14），66.5（C－15），28.9（C－16），33.6（C－17），196.2（C－18）；以上波谱数据，参照文献［10］，基本一致，确定该化合物为 Tricycloalternarene 3a.

化合物4：黄色油状物，分子式：C21H30O3，ESIMS m／z：331［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：1.68（s，H－1），1.56（s，H－2′），4.97（t，J＝7.0Hz，H－3），2.53（m，H－4），5.23（t，J＝7.0 Hz，H－5），1.65（s，H－6′），2.78（m，H－7），1.83（m，H－8），1.86（m，H－9a），2.18（m，H－9b），1.37（s，H－10′），1.97（m，H－11），2.15（m，H－12a），2.33（m，H－12b），4.41（m，H－15），2.04（m，H－16a），2.29（m，H－16b），2.35（m，H－17a），2.67（m，H－17b）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：25.6（C－1），131.5（C－2），17.6（C－2′），123.2（C－3），26.5（C－4），127.3（C－5），133.9（C－6），18.3（C－6′），41.8（C－7），25.（C－8），37.8（C－9），87.8（C－10），22.8（C－10′），43.4（C－11），15.9（C－12），107.9（C－13），167.2（C－14），66.1（C－15），28.9（C－16），33.4（C－17），197.4（C－18）；以上波谱数据，参照文献［11］，基本一致，确定该化合物为Tricycloalternarene F.

3 化合物的药理活性

近年来，EGFR，VEGFR，c－Met等都已成为肿瘤治疗的新靶点［12］，因此本文采用均相时间分辨荧光技术，使用HTRF®KinEASE®TK试剂盒测定了所得化合物对三种受体酪氨酸激酶（EGFR，VEGFR－1，c－Met）的抑制活性.设计阳性组、阴性组、空白组和给药组四个组，三种受体酪氨酸激酶的阳性药分别为Erlotinib、Pazopainib和BMS－777607.阳性药给药浓度和化合物1－4的给药浓度均为200nM，每个浓度2个复孔，测试结果表明（见表1），化合物3和4对三种酪氨酸激酶（EGFR，VEGFR－1，c－Met）具有较强的抑制活性.

表1 化合物1－4对受体酪氨酸激酶的抑制活性

4 结 语

本实验前期从Alternariasp.中分离得到7个化合物，包括4个环肽类化合物和3个聚酮类化合物［4］.本文继续对该菌株的次级代谢产物进行研究，得到4个系列混源萜类化合物，并首次初步测定了Tricycloalternarene类化合物的受体酪氨酸激酶的抑制活性，测试结果表明，化合物3和4对三种酪氨酸激酶具有较强的抑制活性，为该类混源萜类化合物的活性研究开辟了一条新的途径.

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