中华剑角蝗内生真菌Penicillium oxalicum次级代谢产物Secalonic acid A的分离及毒性实验研究

杨小姣 邹 坤 尉小琴 程 凡 覃慧林 贺海波 徐 帮 涂 璇

（1.三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ＆ 湖北省土家族药物研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学 人民医院 ＆宜昌市第一人民医院，湖北 宜昌 443002）

昆虫物种丰富，分布极为广泛，在地球上处处可见其踪迹.根据资料记载当前地球上生存的昆虫物种大约有100多万，是植物的3倍多［1－2］.昆虫为了生存的需要，其体内存在着种类繁多的微生物（内生菌），它们与昆虫一道长期共存.近年来，国内外的学者研究发现，昆虫与其体内的微生物在共同生存过程中能够产生许多具有鲜明结构特征、功能作用特色和良好生物活性的代谢及次生代谢产物，并由此开发出了大量的药物中间体和新药［3－5］.中华剑角蝗为直翅目蝗总科剑角蝗科剑角蝗属的Acrida cinerea，又名中华蚱蜢、东亚蚱蜢等，广泛分布于我国的南方、华北、东北、西北、青海、西藏等地区.营养学家研究发现，中华剑角蝗是一种优质的营养来源，其体内含有种类丰富的氨基酸、蛋白质、脂肪、多种矿物质及维生素［6－7］.

近年来，开展了中华剑角蝗的相关研究，先后从其肠道中分离28株内生真菌，并进行了逐一鉴定，其中一株经ITS rDNA分子生物学鉴定为Penicillium oxalicum［8］，通过进行Penicilliumoxalicum次级代谢产物的分离、纯化，得到了Secalonic acid A.前期在细胞水平研究显示，该化合物对多种肿瘤细胞如人肝癌细胞（HepG2）、人肺癌细胞（A549）、人宫颈癌细胞（Caski）、鼻咽癌细胞（CNE2）和人乳腺癌细胞（MDA－MB－231）均有显著的生长抑制作用，IC50值分别为1.12、2.23、4.16、20.18和22.65μM，但对正常细胞如人永生化表皮细胞（HaCAT）和犬肾细胞（MDCK）的细胞毒性较小，IC50值大于100μM，同时还发现其对细胞具有一定的选择性［9］.本研究拟在此基础上在动物水平上开展其毒副作用实验研究，为其临床应用提供理论基础和实验依据.

1 材料

1.1 菌株

中华剑角蝗采自神农架林区大九湖公园，从其肠道中内生菌，经涂璇副教授鉴定为其中的一株为Penicilliumoxalicum（草酸青霉），实验中采用此菌株进行实验研究.

1.2 培养基

PDA培养基：去皮土豆200g，切成1×1×1cm3块，煎煮1h后，过滤，取滤液，依次加入20g葡萄糖、20g琼脂，然后加水至1 000mL；SDA培养基：取40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂，然后加水至1 000 mL.将上述两种培养基经1.25×105Pa，灭菌20min后，备用.

1.3 动物

SPF级昆明小鼠，雄性，体重18～22g，由三峡大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2011－0012.动物受试环境，屏障系统；实验动物使用许可证号，SYXK（鄂）2011－0061；实验动物从业人员合格证号，Y20101234；饲料、饮水、垫料均符合《湖北省实验动物质量控制标准》.

1.4 试剂

石油醚、乙酸乙酯，天津天力化学试剂公司；三氯甲烷、甲醇，天津恒兴化学试剂公司；乙腈、甲醇，加拿大CALEDON LABORATORIES LTD公司；柱层析反相 硅 胶，YMC－GEL ODS－A，12nm，S－5μm，AA 12S50；Sephadex LH－20，美国Pharmacia公司，薄层色谱硅胶，青岛海洋化工有限公司；柱色谱正相硅胶，烟台化学工业研究所；其余试剂均为市售分析纯.

1.5 仪器与设备

JA2003型电子分析天平，上海天平仪器厂；Vortex－Genie 2型涡旋振荡器，美国奥然科技有限公司；TP1020型脱水机，德国Leica公司；ULTRACUT R型超薄切片机，德国Leica公司；CS－V1型摊片烤片机，孝感市宏业医用仪器有限公司；DMR型多功能显微镜及图像分析系统，德国Leica公司；Olympus KX41型倒置显微镜，美国Thermo公司.

2 方法

2.1 中华剑角蝗肠道内生真菌的分离、纯化及鉴定

取饥饿24h中华剑角蝗在无菌条件下解剖，取出的蝗虫肠道在3%～10%的NaClO溶液中表面消毒5min，用75%EtOH消毒、超纯水洗涤后，置于洁净中研钵中加适量超纯水研磨，取上清液稀释成10－1，10－2，10－3，10－4浓度，然后取0.2mL 接种于PDA培养基上，放置在培养箱中培养.当菌丝长出后，取菌丝接种到新的PDA培养基上，如此重复3次后，再将其转接到试管斜面上，提取基因组DNA，设计了通用引物对分离得到的菌株的总DNA进行扩增，然后进行DNA测序，将测序结果在NCBI的Blastn上进行序列相似性比对，最后鉴定3MZ－15为Penicilliumoxalicum（如图1所示）.

图1 中华剑角蝗肠道内生真菌分离、纯化及鉴定

2.2 Penicillium oxalicum 次级代谢产物Secalonic acid A分离

Penicilliumoxalicum（3MZ－15）菌株用SDA培养基发酵40L，28℃培养20d，发酵液用8层纱布过滤后，分为上清液和菌丝体.上清液用乙酸乙酯萃取至无色，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干，得乙酸乙酯部位（12.2g）.菌丝体在60℃条件下干燥，称重（43 g），用甲醇：氯仿（1∶1）在60℃水浴锅中浸泡提取，提取液用棉花纱布过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干，获得菌丝体部位浸膏（10.6g）.取乙酸乙酯部位浸膏及菌丝体部位浸膏，用甲醇充分溶解，分别用石油醚：乙酸乙酯；乙酸乙酯：甲醇；氯仿：甲醇各梯度进行TLC分析，摸索最佳柱色谱分离条件，经综合分析后选择氯仿－甲醇体系进行梯度洗脱，且氯仿－甲醇为4∶1时使其所有的点展开两部分浸膏，并分别对两部分浸膏进行HPLC分析区别不大故将上述浸膏合并置于冰箱保存.总浸膏低温条件下析出大量黄色针状结晶，纯化得Secalonic acid A（如图2所示）.

2.3 Secalonic acid A急性毒性实验剂量的确定

图2 Secalonic acid A制备分离

根据国内外毒性试验设计基本原则，采用序贯法来初步确定急性毒性实验的剂量.在Secalonic acid A的急性毒性试验中，初步拟定了175、550、1 750、5 000mg／kg 4个剂量.在配制溶液过程中，发现Secalonic acid A溶解性较差，无法将5 000mg的Secalonic acid A溶解在40mL的橄榄油中，故放弃该剂量.在实验给药中的剂量为175、550、1 750mg／kg.

2.4 Secalonic acid A的LD50测定

昆明小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，清洁级，购自三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2011－0012.动物受试环境：屏障系统，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2011－0061，实验动物从业人员合格证号：Y20101234.饲料、饮水、垫料均符合《湖北省实验动物质量控制标准》.实验小鼠禁食12h，不禁水，随机分为4组：空白对照组和Secalonic acid A三个剂量给药组，每组10只，分别按照175、550、1 750mg／kg药物剂量（用橄榄油溶解），1次灌胃，灌胃体积为40mL／kg，空白对照组灌胃给予同体积的橄榄油.即刻及连续观察7d，详细记录小鼠死亡数目、时间及主要毒性反应.利用概率单位法计算小鼠Secalonic acid A的LD50和95%的可信限.

2.5 实验小鼠一般观察

实验期间逐日观察小鼠外部体征、行为活动、尿、粪便性状、口鼻眼分泌物及摄食量、饮水情况；实验中，若出现动物死亡，即刻解剖，用肉眼观察动物各器官外观变化，然后进行组织形态学分析.

2.6 小鼠组织病理学研究

一般观察结束后，取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、十二指肠、大小肠等分别进行肉眼观察和组织形态学分析.

2.7 数据统计分析

实验数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析进行多组间差异的比较分析；以Dunnett－t检验比较两组间均数的差异；P＜0.05认为差异有显著性.

3 结果

3.1 Secalonic acid A结构鉴定

Secalonic acid A为黄色针状晶体，结合文献报道［10－12］和实验中波谱数据结果，确定该化合物为Secalonic acid A（如图3所示）.

3.2 Secalonic acid A对实验小鼠一般状况影响

图3 Secalonic acid A结构

研究发现，实验小鼠灌胃给予Secalonic acid A后，静卧少动，部分小鼠毛被松散，泪液增多和黑色稀便；死亡前出现呼吸急促、抽搐等状况.观察期间各组动物死亡时间及数目见表1.

表1 各组小鼠死亡只数及死亡时间表

3.3 Secalonic acid A对实验小鼠系统尸解的影响

将频临死亡动物进行尸解，肉眼观察机体各器官，可见肝脏表面呈红褐色，有少量出血点，胃肠臌胀，小肠充血扩张余器官肉眼观未见明显异常（如图4所示）.

图4 实验小鼠的肉眼观察图片

3.4 病理组织学检查

光学显微镜下观察，可见心肌内可见明显的变性和坏死；心肌纤维变长呈波浪形，排列紊乱和断裂；肌纤维间距增宽，肌节缩短，排列不规整；间质水肿、充血或出血，有炎症细胞浸润.在肾小管上皮细胞表现为严重变性，近、远曲小管内膜脱落，肾小管内颗粒管型和蛋白管型，集合管间质大面积痕血，肾间质炎细胞浸润.在小肠表现为粘膜表面浅表炎症，表层柱状上皮部分脱落，脾脏出现大面出血性坏死，其余脏器：如大肠、胃、肝主要表现为轻度淤血（如图5所示）.

3.5 LD50的估算

由表2可初步估算出Secalonic acid A的LD50大约为100～200mg／kg，其准确的LD50剂量还需进一步实验.

图5 小鼠主要脏器HE染色照片

表2 小鼠给予各浓度Secalonic acid A灌胃试验结果

4 讨 论

本实验首次从中华剑角蝗的肠道内生菌Penicilliumoxalicum的代谢产物中分离出Secalonic acid A，在前期研究证实具有良好的抗肿瘤活性的基础上，进行了小鼠急毒性实验研究.从当前Secalonic acid A的急性毒性实验结果可以发现，该化合物的LD50大约为100～200mg／kg，具有较强的毒性，其毒性机制目前正在进一步研究之中.

［1］ 戈惠明，谭仁祥.共生菌－新活性天然产物的重要来源［J］.化学进展，2009，21（1）：30－46.

［2］ 张应烙.昆虫共生菌－新型药物分子的广泛来源［C］.2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集.2011.

［3］ 谭周进，肖启明，谢丙炎.昆虫内生菌研究概况［J］.微生物学通报，2005，32（4）：140－143.

［4］ Wagenaar M M，Gibson D M，Clardy.Akanthomycin，a New Antibiotic Pyridone from the Entomo Pathogenic Fungus Akanthomyces Gracillis［J］.Organic Letters，2002，4（5）：671－673.

［5］ Lang G，Blunt J W，Cummings N J，et al.Paecilosetin，a New Bioactive Fungal Metabolite from a New Zealand Isolate of Paecilomyces farinosus［J］.J Nat Prod，2005，68（5）：810－811.

［6］ 田方文.鲁北中华剑角蝗生物学特性初步观察［J］.植物保护，2009，35（4）：147－148.

［7］ 林育真，许士国，战新梅.中华剑角蝗的营养成分与利用评价［J］.昆虫知识，2000，37（4）：218－220.

［8］ 陈君芝，涂 璇，程 凡，等.中华剑角蝗肠道共生真菌的分离鉴定及抑菌活性筛选［J］.三峡大学学报：自然科学版，2014，36（3）：108－112.

［9］ 喻梦岚，徐 帮，程 凡，等.中华剑角蝗共生真菌Penicilliumoxalicum中抗肿瘤次级代谢产物研究［J］.天然产物研究与开发，2014，26：1165－1169.

［10］Steyn P S.The Isolation，Structure and Configuration of Secalonic Acid D，the Toxic Metabolite of Penicillium Oxalicum［J］.Tetrahedon，1970，26（1）：51－57.

［11］Steffens J C，Robeson D J.Secalonic acid A，a Vivotoxin in Pink Root－infected Onion.Phytochem［J］.1987，26（6）：1599－1602.

［12］Chen L，Gu Q Q.Study on the Antitumor Metabolites of a Sponge－Derived Fungus，Aspergillus repens［J］.Periodi Ocean Univer China，2010，40（5）：69－71.