响应面优化微波辅助提取甜菜红色素及其稳定性研究

刘英丽，李福芳，张慧娟，王　静，邸斯婕（北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京100048）

分离提取

响应面优化微波辅助提取甜菜红色素及其稳定性研究

刘英丽，李福芳，张慧娟，王静*，邸斯婕
（北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京100048）

摘要：通过单因素试验对甜菜红色素提取条件（料液比、温度、提取时间、提取液pH、提取溶剂等）进行初步探究，并通过微波辅助对色素提取进行响应面优化设计，结果表明影响提取最显著的因素是微波时间，其次是微波功率，最后是料液比。最适提取条件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波时间112.8 s，此条件甜菜红色素最大吸光度值为0.711 4。对提取的甜菜红色素进行超滤处理并对其粗提液进行稳定性研究，结果表明光照、pH对其稳定性影响显著，添加不同稳定剂对甜菜红色素稳定性有一定改善，苯甲酸钠（0.04%）和VC（0.04%）复配使用对于提高其稳定性作用较为明显。

关键词：甜菜；色素；微波辅助提取；响应面优化法；稳定性

甜菜是我国北方的一个主要糖来源，种植较多。其根部含有极为丰富的红色素，主要的色素成分是甜菜红（Betalains），占色素总量的70%～90%，包括红色的甜菜红素（Betacyanins） 及黄色的甜菜黄素（Betaxanthins），是很好的色素来源[1]。西欧每年大约产出20万t以上的甜菜根，其中大约有10%加工做为色素用途[2]。由于天然植物色素色泽鲜亮，食用安全，具天然抗氧化、抗衰老等特点在食品工业领域的果汁、冰激凌、点心、罐头、糖果、酸奶等产品中得到了广泛的应用[3-4]。关于甜菜红色素的提取研究大多是用传统的溶剂萃取法，方法简单但耗时长，提取率低，用于工业化生产效率低[5-6]。本研究对微波辅助提取条件进行了优化，并采用响应面法来优化天然物提取工艺，使提取效率与甜菜红色素的产量得到较大幅度提升。同时，由于甜菜红色素的稳定性是甜菜作为天然色素在食品中应用的最大限制，其稳定性的研究也成为一个亟待解决的问题和着眼点[7-9]，本研究试图通过加入稳定剂，包括防腐剂和抗氧化剂等探索一个能够提高甜菜红色素稳定性的方法，为甜菜红色素的扩大应用提供一定的借鉴和指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

红甜菜：购于吉林农安县；苯甲酸钠D-异维生素钠VC柠檬酸均为食品级；实验室各种常规化学试剂均为分析纯。

刨丝器：购于超市；UV-2450紫外可见分光光度计：岛津；恒温水浴锅：山东华鲁电热仪器有限公司；XH-100A电脑微波催化合成仪/萃取仪：祥鹄科技；超声设备、JDX-02型超声波电源：北京金星超声波设备技术有限公司；MSC超滤杯300 mL装量、超滤膜截留分子量6000：上海摩速科学器材有限公司；601型搅拌式电极架：上海三信仪表厂。

1.2方法

1.2.1原料预处理

新鲜红甜菜，清洗去皮，刨丝（直径3 mm～4 mm）待用。

1.2.2提取工艺流程

红甜菜丝加入一定比例的提取溶剂，静置搅拌/微波/超声处理一段时间后，用纱布滤掉甜菜丝，滤液离心，再用滤纸抽滤，静置10 min，稀释（取0.4 mL加入10 mL水），于535 nm处测定吸光度值A。

1.2.3甜菜红色素提取的单因素试验条件优化

1.2.3.1时间对提取效果的影响

准确称量30 g甜菜丝，加入一定量的水溶解，设置六组实验，分别放置1、2、3、4、5、6 h，每半个小时搅拌一次，每次搅拌5 min，后过滤布过滤、滤纸抽滤，静置10 min，取上清液稀释相同倍数，于535 nm处测定吸光度值A。

1.2.3.2料液比对提取效果影响

准确称量30 g甜菜丝，分别加入60、120、150、180、210 mL水溶解，放置4 h，每个半小时搅拌一次，每次搅拌5 min，后过滤、离心，取上清液稀25倍，于535 nm处测定吸光度值A。

1.2.3.3温度对提取效果的影响

准确称量30 g甜菜丝，加入一定量水溶解，设置5组实验，分别在20、40、50、60、70℃下水浴加热4 h，后进行如上相同的处理，并于535nm处测吸光度值A。

1.2.3.4溶剂对提取效果的影响

准确称取30 g甜菜丝，设置五组实验，分别加入相同体积的水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇溶解，提取4 h，后进行如上相同的处理，并于535 nm处测其吸光度值A。

1.2.3.5pH对提取效果的影响

用柠檬酸和磷酸氢二钠配置一系列不同pH的缓冲溶液，用pH分别为3、4、5、6、7、8的缓冲溶液提取甜菜红色素，其他提取条件如上，并进行如上相同处理，于535 nm处测吸光度值A。

1.2.4响应面法优化微波辅助提取甜菜红色素工艺

根据Box-Benhnken响应面优化试验设计，选取料液比、微波功率和微波时间3个因素，采用三因素的响应面分析方法优化甜菜红色素提取工艺。Box-Benhnken响应面优化试验因素水平编码，如表1。利用design expert7.0.0进行响应面分析。

表1　Box-Benhnken响应面优化实验因素水平编码表Table 1　Box-Benhnken experimental factor level coding table

1.2.5甜菜红色素的稳定性研究

用外压式超滤杯截留分子量为6 000 Da的超滤膜对提取液进行超滤，目的是为了除去其中的大分子多糖、蛋白质等的干扰[10]，并对其稳定性进行研究，了解光照，不同pH以及稳定剂对甜菜红色素稳定性的影响。

1.2.5.1光照对甜菜红色素稳定性的影响

将粗提后的甜菜红色素溶液，分别取适量至于两个锥形瓶内，一个放在阳光充足的地方，另一个用锡纸进行避光处理。每隔1、2、4、6、8、12、16天测一次吸光度值。

1.2.5.2pH对甜菜红色素稳定性的影响

将粗提后的甜菜红色素溶液的pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9，常温下避光低温保存，每隔1、2、4、6、8、12天测一次吸光度值。

1.2.5.3稳定剂对甜菜红色素稳定性的影响

将粗提后的甜菜红色素溶液稀释，分别加入一定比例的稳定剂：苯甲酸钠（0.02%、0.04%）、VC（0.02%、0.04%）、柠檬酸（0.02%、0.04%），D-异维生素钠（0.02%、0.04%），一周后观察甜菜红色素提取液颜色及其品质变化，选取比较好的实验组所含的添加剂进行单独添加及复配试验，做时间-吸光度值变化曲线，每隔1、2、4、6、8、12天测一次吸光度值。

1.3数据处理

采用平均数±标准差表示试验数据，在图表内表现为误差线的高低，t值进行显著性分析，应用Spss软件进行差异性分析。响应面试验采用Design-Expert 7.0.0软件进行数据分析。

2　结果与分析

2.1单因素对甜菜红色素提取率的影响

料液比、时间、温度、pH、溶剂等对提取率的影响见图1～图5。

图1　料液比对提取率的影响Fig.1　Impact of extraction liquid ratio on yield

如图1所示，随着料液比的增加，提取的甜菜红色素的浓度增加，加水量为甜菜丝质量的2倍到5倍增加时，提取色素浓度增加明显，增加到6倍～7倍时，甜菜红色素浓度也有一定程度的增加，但增加幅度不大，考虑到加水量越大，浓缩成本越高。因此并非加水量越多越好。综上所述，加水量为5倍时，提取效果最佳。

图2　时间对提取率的影响Fig.2　Impact of extraction time on yield

如图2所示，随着提取时间的延长，甜菜红色素浓度呈上升趋势，超过4 h后，提取的甜菜红色素浓度变化不大，甚至有略微下降。综上所述，最佳提取时间为4 h。

图3　温度对提取率的影响Fig.3　Impact of extraction temperature on yield

如图3所示，甜菜红色素是一种热不稳定的色素，随着温度升高，甜菜红色素结构遭到破坏，在此过程中对甜菜红色素影响较大的是多酚氧化酶活性[11-12]。在较低温度时，温度升高，多酚氧化酶活性升高，提取甜菜色素部分被氧化，不利于甜菜红色素的提取[11，13]。50℃～60℃时，多酚氧化酶活性最高，超过60℃，多酚氧化酶活性降低。图3中20℃～50℃甜菜提取率呈下降趋势，而在60℃有所升高，可能是温度对多酚氧化酶活性有所抑制，甜菜提取率呈现一定升高趋势，但温度继续升高，甜菜提取率下降，原因是甜菜红色素热稳定性较差，温度升高，破坏了甜菜红色素的结构。综上所述，常温20℃提取，是最经济也是最有效的提取温度条件。

图4　乙醇浓度对提取率的影响Fig.4　Impact of ethanol concentration on yield

图5　pH对提取率的影响Fig.5　Impact of pH on the yield

如图4所示，甜菜红色素是水溶性色素[14]，在水中溶解度较好，用系列浓度的乙醇溶液提取，50%乙醇提取效果略微高于水提取，但从经济角度来说，选水作为提取溶剂比较合适。

如图5所示，随着提取液pH由低到高转变提取的甜菜红色素浓度呈下降趋势。在pH为3时，提取效果达到最佳。

2.2响应面法优化微波辅助提取工艺

根据表1，设计微波辅助提取甜菜红色素的响应面试验，测定稀释相同倍数的提取液读取吸光度值A，试验结果见表2。

表2　微波辅助提取甜菜红色素的响应面数据Table 2　Microwave assisted extraction of red beet pigment response surface data

响应面优化试验方案及结果分析见表3。

表3　回归模型的方差及显著性分析Table 3　Regression model of variance and significant analysis

利用Design-Expert 7.0.0软件进行数据分析，建立关于甜菜提取甜菜红色素产量的响应模型，寻求最优响应因子水平。得到响应值R1（吸光度值）和各因子（料液比A，微波功率B，微波时间C）之间的回归拟合方程：

R1=+0.711 40+0.002 625 00A-0.007 625 00B-0.029 000C+0.013750AB+0.023 000AC-0.00550000BC-0.024 825A2-0.025 325B2-0.042 075C2

从表3可以看出，回归模型的F值为36.61，“Pr＞F”<0.05，说明所得的回归方程拟合的较好，回归效果显著，而失拟项F=2.17、P=0.234 8＞0.05，差异不显著，因此用此回归方程模型来模拟3个因素与指标值的关系是可行的。在这个模型中B、C、AB、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，说明因素影响显著。

三因素影响显著性相比，影响最显著的因素是微波时间，其次是微波功率，最后是料液比。

将料液比、微波功率、微波时间3个参数分别固定，吸光度值随其余两个参数变化趋势如图6～图8。

图6　微波功率和微波时间对提取率的影响Fig.6　Impact of microwave power and time on yield

图7　料液比和微波时间对提取率的影响Fig.7　Impact of liquid ratio and microwave time on yield

从图6～图8可以形象的看出各因素及其交互作用吸光度值的影响。图6为微波功率和微波时间对甜菜提取液浓度的影响，可以看出，甜菜提取液浓度随着微波功率的增加先上升后下降，随着微波时间的增加亦有先升高后下降的趋势。从图7为料液比和微波时间对甜菜提取液的影响，结果表明，料液比和微波时间对甜菜提取液浓度都有显著影响，均是先升高后下降的趋势。图8料液比和微波功率对甜菜提取液浓度的影响中可以看出，料液比和微波功率对甜菜提取液浓度影响显著，亦均是先升高后下降的趋势。

通过Design-Expert软件对试验参数进一步优化得到的最适提取条件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波时间112.8 s，最大吸光度值为0.711 4。此条件下模型拟合系数较高，差异显著。

2.3甜菜红色素的稳定性研究

2.3.1光照、pH对甜菜红色素稳定性的影响

光照处理后的甜菜红色素溶液和经锡纸避光处理的甜菜红色素溶液，其吸光度值的变化见图9；将甜菜红色素溶液调制不同pH下的色素保留量差异如图10；不同pH条件下，甜菜红色素溶液浓度随时间变化如图11。

图8　料液比和微波功率对提取率的影响Fig.8　Impact of liquid ratio and microwave power on yield

图9　光照对甜菜红色素稳定性的影响Fig.9　Impact of sunshine on stability of pigment

由图9可以看出，经避光处理的甜菜红色素溶液比在光照下放置的甜菜红色素溶液的吸光度值变化小，说明光照会影响甜菜红色素溶液稳定性，使其明显降低。但经避光处理的甜菜红色素溶液吸光度值也有很明显的下降，说明光照并不是唯一影响其稳定性的因素，温度、pH等均会影响其稳定性。

将甜菜红色素提取液调至不同的pH，其吸光度值变化如图10，pH在4～6时，甜菜红色素稳定存在。这与甜菜红色素对pH的稳定性有关，当pH<4时，甜菜红色素由红色向紫色转变；pH＞7时，甜菜红色素也是向紫色转变。当pH＞10时，甜菜红碱会转变为甜菜黄碱，颜色转变为黄色[15]。不同pH条件下，甜菜红色素提取液的浓度随时间的变化如图11，甜菜红色素提取液在pH=4～6时，相对比较稳定。

2.3.2稳定剂对甜菜红色素溶液稳定性的影响

将粗提后的甜菜红色素溶液稀释，分别加入一定比例的稳定剂：苯甲酸钠（0.02%、0.04%）、VC（0.02%、0.04%）、柠檬酸（0.02%、0.04%），D-异维生素钠（0.02%、0.04%）。7天后观察其色素溶液颜色变化，结果见表4。

图1　0　不同pH条件下甜菜红色素保留量Fig.10　Impact of pH on retention

图1　1　不同pH条件下甜菜红色素稳定性Fig.11　Impact of pH on stability of pigment

表4　不同种类、浓度的稳定剂对甜菜红色素稳定性的影响Table 4　Impact of various kinds and concentration of stabilizer on the stability of the pigment

由表4可以看出，苯甲酸钠（0.04%）和VC（0.04%）对于提高甜菜红色素稳定性效果较为显著，可用于甜菜红色素提取液的稳定性研究。苯甲酸钠（0.04%）和VC（0.04%）单独添加及复配使用对甜菜红色素溶液稳定性的影响如图12。

图1　2　苯甲酸钠、VC及其复配使用对甜菜红色素溶液稳定性的影响Fig.12　Impact of sodium benzoate，VCand both two on stability of pigment

结果表明，苯甲酸钠和VC对甜菜红色素的稳定性均有显著提高，其复配使用效果最佳。

3　结论

本研究首先通过单因素实验确定了合适提取甜菜红色素的条件为：最适料液比1∶5（g/mL），温度20℃，提取时间4 h，提取液pH=3，综合高效经济等因素提取溶剂选取水作提取溶剂。借助微波辅助提取条件的优化，对微波辅助提取色素做响应面优化实验，并对其显著性进行分析，结果表明对提取率影响大小为：微波时间＞微波功率＞料液比。最终得到其最适提取条件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波时间112.8 s，最大吸光度值为0.711 4。此条件模型拟合系数较高，差异显著。用超滤杯对提取的甜菜红色素进行粗提并进行稳定性研究，结果表明光照、pH对其稳定性影响显著。添加不同稳定剂对甜菜红色素稳定性有一定改善，苯甲酸钠（0.04%）和VC（0.04%）复配使用对于提高稳定性作用较明显。

通过本研究的探索可以得出甜菜红色素的最佳提取工艺，获得产率较高，同时通过不同稳定剂的研究，对于扩大甜菜红色素在食品领域的应用有重要的意义，但是这种稳定性的提高具一定的局限性，甜菜红色素当前只是较适用于饮料、冰激凌等食品中，对于需要高温加热的食品如添加到肉制品进行护色等方面还不尽人意，有待于进一步研究和开发。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.012

收稿日期：2014-06-17

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31271976）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B05）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目（CIT&TCD20130309，IDHT20130506）

作者简介：刘英丽（1981—），女（汉），讲师，博士，主要从事食品品质改良方面的研究。

*通信作者

Response Surface Methodology for Optimizing Microwave Assisted Extraction of Betalain from Beet and Its Stability Studies

LIU Ying-li，LI Fu-fang，ZHANG Hui-juan，WANG Jing*，DI Si-jie
（Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Abstract：The appropriate extraction conditions of betalain from beets by single factor experiment（solvent ratio，temperature，extraction time，pH，extraction solvent）were determined.On the basis of that conclusion，using response surface methodology（RSM）for optimizing extraction of betalain investigated the effects of solvent/material ratio，microwave output power and micro-wave time.The results showed that among the three factors the microwave time most significantly affected on the absorbance，followed by the microwave output power and the solvent/material ratio.The optimal conditionswere asfollows：solvent/material ratio 1∶5.76（g/mL），microwave output power 398 W and microwave time 112.8 s，the highest absorbance was 0.711 4.Through ultrafiltration and the stability was studied，research found that the sunshine and pH had significant impact on the stability.Different stabilizers have a certain improvement on the stability of betalain，and using of sodium benzoate（0.04%）and VC（0.04%）together can improve its stability significantly.

Key words：beet；pigment；microwave assisted extraction；response surface methodology（RSM）；stability