黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的萃取工艺优选

缪菊连，王成军，刘海周（.大理学院药学与化学学院，云南大理67000；.云南中医学院，云南昆明65000）

黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的萃取工艺优选

缪菊连1，王成军1，刘海周2
（1.大理学院药学与化学学院，云南大理671000；2.云南中医学院，云南昆明650200）

摘要：以超临界CO2进行萃取，采用HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，优选的萃取条件为压力30 MPa，温度45℃，CO2流量20 L/h，夹带剂为95%乙醇，加入量为药材重的5%，萃取时间2 h，粉碎粒度60目，萃取率为0.558 mg/g，结果显示超临界CO2萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷有效可行。

关键词：黄芪；超临界CO2；毛蕊异黄酮葡萄糖苷

黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效[1]，黄芪的化学成分复杂，主要有皂苷类、黄酮类及其苷类、多糖类、氨基酸类等[2]，毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄酮类中活性教高的一种，有抗病毒、抗菌、降血脂、抗氧自由基、抗缺血和改善血象等作用[3-4]。报道中主要是黄芪甲苷的提取方法[5-7]，而2010年版药典中“黄芪”项下增加了毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量控制，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量低，提取工艺报道较少，寻求一种高效优质的提取工艺历来是中医药专家们研究点的热点，超临界流体特别是超临界CO2具有无毒、不燃烧、对环境友好、产品质量高、提取时间短，无溶剂残留等优点，在分析、化工、材料、色谱等方面显示出广阔的前景[8-10]。目前，利用超临界CO2萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖少见报道，为提高毛蕊异黄酮葡萄糖苷的提取率，现研究利用超临界CO2提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷工艺的可行性及最佳工艺的优选，为寻找更好更有效率的毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取工艺提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

HA221-50-06超临界萃取装置：江苏华安科技有限公司；1100型高效液相色谱仪：美国Agilent；XS125A型电子天平：上海光学仪器一厂；RE-52型旋转蒸发仪：上海博通；SHZ-D循环水式真空泵：河南巩义市英峪豫华仪器厂；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：20633-67-4）：中国食品药品检定研究院提供；甲醇为色谱纯，乙腈为分析纯，提取试剂均为工业纯。黄芪药材经云南中医学院杨树德教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus （Bge.）Hsiao的干燥根。

1.2方法

1.2.1毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定[1]

按2010年版《中国药典》一部“黄芪”药材的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法进行测定。

1.2.2样品的处理

精密吸取黄芪萃取液5 mL回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样前用0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得可测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的供试品溶液。

1.2.3超临界CO2萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷工艺参数优化

用CO2作为萃取剂，从可能影响毛蕊异黄酮葡萄糖苷萃取的萃取压力、粉碎粒度、萃取温度、萃取时间、CO2流量及夹带剂和夹带剂的量等进行单因素及正交试验优选。萃取方法：称取一定粉碎度的黄芪药材适量，装入萃取釜中，对萃取釜、解离釜进行加热，当达到所选定的温度时，开启CO2瓶，通过高压泵对系统加压，当萃取釜、解离釜压力分别达到所设定的压力时，以一定的速度加入夹带剂，调节CO2的流量到一定值，保持恒温恒压进行萃取，当达到所选定的萃取时间后，从解离釜出料口出料，收集保存，按“1.2.2样品处理”后进行含量测定。

2　结果与分析

2.1对照品与样品图谱

对照品与样品图谱见图1、图2。

图1　对照品色谱图Fig.1　HPLC chromatograms of reference substance

图2　样品色谱图Fig.2　HPLC chromatograms of reference sample

2.2夹带剂的种类优选

根据预试验，不加入夹带剂时几乎提取不出毛蕊异黄酮葡萄糖苷，只能起到除杂作用，除杂的工艺条件优选为萃取压力为15 MPa，萃取温度为45℃，萃取0.5 h，CO2流量为10 L/h。据毛蕊异黄酮葡萄糖苷的理化性质及参考文献，精密称取黄芪药材适量除杂后，选择95%的乙醇、40%乙醇及丙酮为夹带剂，加入量为药材量的10%的体积数（下同），萃取压力为30MPa，萃取温度为45℃，萃取2 h，CO2流量为15 L/h进行萃取，得到的产品按样品处理方法进行处理，测定含量，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取率分别为0.33、0.17、0.21 mg/g，故选择95%的乙醇为夹带剂。

2.3.2夹带剂量的选择

精密称取黄芪药材适量除杂后，按药材量的5%、25%、45%分别加入95%乙醇，按萃取压力为30 MPa，萃取温度为45℃，萃取2 h，CO2流量为15 L/h进行萃取，得到的产品按样品处理方法进行处理，测定含量，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取率分别为0.35、0.36、0.35 mg/g，夹带剂的用量影响很小，故选择夹带剂的量为药材量的5%。

2.2粉碎粒度[11]

精密称取分别过10、20、40、60、80目的黄芪粉末适量除杂后，加入药材量5%的95%乙醇，按萃取压力为30 MPa，萃取温度为45℃，萃取2 h，CO2流量为15 L/h进行萃取，得到的产品按样品处理方法进行处理，测定含量，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取率分别为0.15、0.21、0.25、0.36、0.31 mg/g故选择过60目筛。

2.3提取时间

精密称取过60目筛的黄芪适量除杂后，加入药材量5%的95%乙醇，按萃取压力为30 MPa，萃取温度为45℃，CO2流量为15 L/h分别提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，按上述方法进行测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取率分别为0.08、0.17、0.28、0.40、0.40 mg/g，故选择提取时间2.0 h。

2.4毛蕊异黄酮葡萄糖苷提取工艺的优选

通过查阅文献、单因素试验及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的性质，设计L9（34）优选压力、温度及流量对超临界CO2萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的影响。药材过60目筛，夹带剂为95%乙醇，加入量为药材重的5%，提取2h，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的提取率为考察指标。因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1　因素水平Table 1　Factors and levels

表2　正交试验结果Table 2　Result of orthogoncd test

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

由极差R可知，各因素对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的萃取率的影响次序为A>C>B，较好的萃取方案为A3B2C3，即较佳的萃取工艺为：萃取压力30 MPa，温度45℃，二氧化碳流量20 L/h。

2.5工艺验证

取5份黄芪药材，按上述较佳工艺条件进行验证试验结果见表4。

表4　工艺验证试验Table 4　Results of confirmatory experimeint

由表4可知，平均提取率0.558 mg/g，RSD%＝1.50%<5%，平均纯度57.4%RSD%＝1.99%<5%说明工艺稳定。

3　结论与讨论

单因素及正交试验优选得出超临界CO2萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最佳条件为压力30 MPa，温度45℃，CO2流量20 L/h，夹带剂为95%乙醇，加入量为药材重的5%，萃取时间2 h，粉碎粒度60目，萃取率为0.558 mg/g。

超临界CO2在较低温度下进行，对生理活性物质破坏较小；而且具有操作简单，过程短，萃取效率高，无有机溶剂残留，不污染环境等优点。因此，超临界CO2技术更符合现代化工业生产要求。本试验中除杂与提取一体化进行，除杂后CO2降压循环使用，提高溶剂的利用率，夹带剂加入量较少（药材量的5%），常规提取溶剂加入量至少是药材的10倍左右，超临界CO2很少的溶剂加入量即可达到很好的提取效果，温度低（45℃）不影响毛蕊异黄酮葡萄糖苷的活性。传统的黄芪除杂是利用石油醚加热回流除去[12]，加热时间长，可能会影响毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，试验中采用传统除杂与超临界除杂进行对比，传统除杂后超临界CO2萃取物得率为0.483 mg/g，纯度为46%，而用超临界CO2除杂及萃取后萃取物得率为0.558%，纯度为57.4%。超临界CO2更适合黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的提取及除杂。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版一部[S].北京:化学工业出版社,2010:283

[2]邱勇波,刘锦,武飞.黄芪化学成分及药理作用研究进展[J].中国疗养医学,2011,20(5):435

[3]温艳梅.黄芪的化学成分研究进展[J].中成药,2006,28(6):879

[4]罗春霞,林平川,谷丽华,等.高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮7-O-B-D吡喃葡萄糖苷的含量[J].中国中药杂志,2003,28 (7):6031

[5]张华,陈新梅.纤维素酶提取黄芪有效成分工艺研究[J].中华中医药学刊,2011,29(8):1832-1833

[6] 陈涛,李进,禇治德,等.黄芪药材微波提取工艺研究[J].时珍国医国药,2009,20(2):349-350

[7]陈宇红.超细粉碎对黄芪有效成分溶出的影响[J].宁夏医学杂志, 2007,29(3):215-217

[8]Casal E,RamAArez P,IbaAAez E,et al.Effect of supercritical carbon dioxide treatman on the maillard reaction in model food systems[J]. Food Chemistry,2006,97(2):272-276

[9]Liu J C,Raveendran P,Shervani Z,et al.Synthesis of Ag and AgI quantum dots in AOT-stabilized water-in-CO microemulsions[J]. Chemistry-A European Journal,2005,11(6):1854-1860

[10]缪菊连,黄照昌.超临界CO2萃取云南香樟叶中右旋龙脑的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(19):8-10

[11]蒙英,赵旭壮,李明.超临界CO2萃取黄芪皂苷的工艺研究[J].食品与发酵科技,2011,47(4):42-44

[12]宋成英,封加福.HPLC法同时测定黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(11):115-117

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.015

收稿日期：2013-12-09

基金项目：大理学院应用开发基金项目（KYYY201204）

作者简介：缪菊连（1977—），女（汉），副教授，硕士研究生，从事药物制剂及分析教学与科研工作。

Optimal Technology of Extraction Calycosin Glucoside from Astragali Radix

MIAO Ju-lian1，WANG Cheng-jun1，LIU Hai-zhou2
（1.Department of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China；2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650200，Yunnan，China）

Abstract：To investigate the technology condition of calycosin glucoside from astragali radix by supercritical CO2fluid extraction，the content of calycosin glucoside determined by HPLC.The optimum extraction technology was as following：extraction pressure was 30 MPa，extraction temparature was 45℃，CO2flow rate was 20 L/h，useing 95%ethanol as cosolvent，cosolvent was 5%，extraction time was 2 h，the size was 60 mesh，extracting rate of calycosin glucoside was up to 0.558 mg/g，the results showsed that supercritical CO2fluid extraction of calycosin glucoside from astragali radix to be effective.

Key words：astragali radix；superctical CO2fluid extraction；calycosin glucoside