纳米金比色法快速检测蔬菜中毒死蜱方法的研究

贝　峰，聂　梅，艾仕云，赵成新（.泰安出入境检验检疫局，山东泰安7000；.山东农业大学化学与材料学院，山东泰安7000）

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纳米金比色法快速检测蔬菜中毒死蜱方法的研究

贝峰1，聂梅1，艾仕云2，赵成新1
（1.泰安出入境检验检疫局，山东泰安271000；2.山东农业大学化学与材料学院，山东泰安271000）

摘要：建立了一种快速检测蔬菜中毒死蜱残留量的比色方法。该方法基于镧（III）功能化纳米金与含氧酸根的配位，加入毒死蜱引起功能化的金纳米粒子发生聚集，使溶液出现红色到蓝色的变化，可以通过用肉眼观察颜色或者用紫外分光光度法检测其吸光度的变化来检测毒死蜱的含量。毒死蜱浓度在5×10-10mol/L～5×10-7mol/L范围内，呈良好的线性关系，检出限为0.1nmol/L（S/N=3）。该方法操作简单、成本低、比色明显，可用于蔬菜中毒死蜱残留的现场检测。

关键词：金纳米粒子；毒死蜱；比色法

毒死蜱（chlorpyrifos）俗称乐斯苯，属中等毒性有机磷杀虫剂，目前已被日本禁止在菠菜中使用，我国也在新国标限量中对其做出了禁用的严格规定。目前国内外对蔬菜中毒死蜱残留的检测技术[1-5]主要有酶抑制法、色谱法、免疫分析法等，这些检测方法虽能检测样品中毒死蜱的含量，却存在费时、费力、成本高，仪器设备昂贵及操作人员专业要求高等缺陷，难以适应现场的实时快速检测。

将镧（III）固定在纳米金粒子表面，形成镧功能化纳米金（AuNPs-La），镧（III）与有机磷农药中的含氧基团结合，形成不溶于水的纳米金、镧（III）和有机磷农药的复合物（AuNPs-La-毒死蜱）使溶液由酒红色变为蓝色，可通过颜色变化来可视化检测有机磷农药，或通过分光光度法定量有机磷农药。

1　材料与方法

1.1材料

UV2450分光光度计：日本岛津；旋涡混合器：广州IKA公司；KQ-100DA型超声波：昆山市超声仪器有限公司；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O Au）、柠檬酸钠：上海化学试剂有限公司；毒死蜱：德国Dr公司；氯化镧（含量≥45%）：上海山浦化工有限公司；试验用水均为二次重蒸水，试剂均为分析纯。

菠菜、绿花菜样品均取自泰安出口蔬菜种植基地。

1.2氯化镧功能化纳米金（AuNPs-La）的制备[6-9]

用柠檬酸三钠还原法制备纳米金颗粒（AuNPs），溶液颜色为红色，在520 nm左右有一吸收峰；取一定量的AuNPs溶液，用ABS溶液稀释到其原浓度的1/4，然后加入一定量的氯化镧溶液，使其浓度为0.10mmol/L，摇匀，静置。

1.3试验条件的优化

1.3.1氯化镧浓度的影响

取一定量的AuNPs溶液，用ABS溶液稀释到其原浓度的1/4，加入浓度为1.5 mmol/L的氯化钠溶液，加入氯化镧溶液，使其浓度依次为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mmol/L，摇匀，再加入最终浓度为5×10-9mol/L的毒死蜱。摇匀，静置，观察溶液颜色的变化，5 min测定紫外可见吸收光谱。

1.3.2pH的影响

取一定量的AuNPs溶液，依次用pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的ABS缓冲溶液稀释到原浓度的1/4，加入浓度为0.10mmol/L的氯化镧溶液，1.5mmol/L的氯化钠溶液，混匀，加入浓度为5×10-9mol/L毒死蜱，摇匀，静置，观察溶液颜色的变化，4 min测定紫外可见吸收光谱。

1.3.3氯化钠浓度的影响

取一定量的AuNPs-La溶液，加入浓度为1.0、1.5、2.0 mmol/L氯化钠溶液，混匀，分别加入浓度为5×10-9、5×10-8、5×10-7mol/L的毒死蜱，摇匀，静置，观察现象。

1.4实际样品的处理

先将蔬菜样品粉碎，向10 g样品中加入一定浓度水平的毒死蜱溶液，放置4 h，用50 mL无水乙醇超声萃取30 min，4 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液至15 mL离心管中，加入600 mg C18，600 mg PSA，400 mg PC，涡流混合1 min，4 000 r/min离心5 min，精确量取一定体积该上清液，用构建的比色法检测。

1.5吸光度差值的计算

文中所用的吸光度差值通过以下公式进行计算：ΔA=A0-Ai，式中：A0是指镧功能化纳米金溶液的吸光度，Ai是指加入毒死蜱后镧功能化纳米金溶液的吸光度。

2　结果与分析

2.1试验原理

试验将镧（III）固定在纳米金粒子表面，形成镧功能化纳米金（AuNPs-La），利用将镧（III）与有机磷农药中的含氧基团结合，形成不溶于水的纳米金-镧-有机磷农药（AuNPs-La-毒死蜱）复合物，颜色由酒红色逐渐变成蓝色。因此可用此性质检测有机磷农药的含量。

2.2氯化镧功能化纳米金（AuNPs-La）与纳米金（AuNPs）的紫外可见吸收光谱

纳米金溶液（AuNPs）与氯化镧功能化纳米金溶液（AuNPs-La）颜色的对比见图1，AuNPs与AuNPs-La的紫外可见吸收光谱见图2。

图1　AuNPs（a）与AuNPs-La（b）颜色的对比Fig.1　Color contrast of AuNPs（a）and AuNPs-La（b）

图2　AuNPs与AuNPs-La的紫外可见吸收光谱Fig.2　UV-vis absorption spectra of AuNPs and AuNPs-La

由图1可知，两种溶液颜色基本相同；由图2可知，AuNPs-La仍在522 nm处有最大吸收峰，峰值也未发生明显的变化。

2.3试验条件的优化

2.3.1氯化镧浓度的确定

不同氯化镧浓度引起的溶液颜色变化见图3。

图3　氯化镧浓度对纳米金颜色的影响Fig.3　Color of AuNPs with different concentration of lanthanum chloride

当氯化镧的浓度不高于0.10 mmol/L时，溶液颜色依然为酒红色，而当氯化镧浓度大于0.10 mmol/L时，溶液则变为浅紫色。不同氯化镧浓度对溶液紫外吸收的影响曲线见图4。

图4　氯化镧浓度对纳米金紫外吸收的影响Fig.4　A of AuNPs with different concentration of lanthanum chloride

当氯化镧浓度高于0.10mmol/L时，ΔA的值才随氯化镧浓度的升高依次增加。因此选择氯化镧的最佳浓度为0.10 mmol/L。

2.3.2pH对试验的影响

溶液pH对吸光度差的影响见图5，pH=5.0时，吸光度差值最大，因此选择pH=5.0为最佳pH。

图5　溶液pH对吸光度差值的影响Fig.5　A of AuNPs-La with different pH

2.3.3氯化钠浓度对试验的影响

氯化钠浓度对试验体系的影响见图6。

图6　氯化钠浓度对试验的影响Fig.6　AuNPs with different concentrations of chlorpyrifos and sodium chloride

氯化钠浓度为1.0 mmol/L时，毒死蜱的浓度由高到低变化时，溶液颜色变化不明显；氯化钠浓度为2.0 mmol/L时，加入毒死蜱浓度极低（5×10-9mol/L）时，溶液就发生聚沉，变为蓝色；氯化钠浓度为1.5 mmol/L时，毒死蜱浓度大于5×10-7mol/L，溶液颜色瞬间发生由红色向蓝色的转变，毒死蜱浓度为5×10-8mol/L，3 min后颜色由红色变成紫色。因此选择氯化钠的最佳浓度为1.5 mmol/L。

2.4毒死蜱聚集的动力学研究

室温条件下，不同毒死蜱浓度引起AuNPs-La的吸光度差变化的动力学研究见图7。

图7　不同毒死蜱浓度下AuNPs-La吸光度差（ΔA）随时间的变化Fig.7　Plot of ΔA versus time at different concentrations of chlorpyrifos

随时间延长，吸光差ΔA逐渐增加，增加趋势趋于平缓的时间分别为：低浓度下（5×10-9mol/L），约120s，中浓度下（5×10-8mol/L），约90 s，高浓度下（5×10-7mol/L），约60 s，说明随着毒死蜱浓度的增加，吸光差达到最大值所用的时间逐渐缩短。在开始的1 min内吸光比迅速增加，随后增加缓慢，几乎在均在2 min内曲线最终趋于平缓，因此可迅速、灵敏的检测毒死蜱的含量。

2.5标准曲线和检出限

不同毒死蜱浓度下AuNPs-La的颜色比对见图8。

图8　不同毒死蜱浓度下AuNPs-La的颜色变化Fig.8　Color of AuNPs with different concentrations of chlorpyrifos

随着毒死蜱浓度的增加，颜色依此由酒红色变成浅紫色最后变成蓝色。不同毒死蜱浓度下AuNPs-La的紫外可见吸收（UV-vis）图谱见图9。

随着毒死蜱浓度的增加，AuNPs-La的吸光度依此降低，降低的幅度依此增大。吸光度差（ΔA）与毒死蜱浓度的线性关系见图10。

在5×10-10mol/L～5×10-7mol/L（R=0.996）浓度范围内，ΔA与毒死蜱浓度的对数成线性关系。根据信噪比S/N=3计算得出毒死蜱的检出限为1×10-10mol/L。

2.6回收率和相对标准偏差

试验在菠菜和绿花菜样品基质中加入了5.0、50.0 和500.0 nmol/L 3个浓度水平的毒死蜱，每个浓度水平6个平行，按照1.4方法进行前处理后，进行回收检测，结果见表1。

图1　0　吸光度差与毒死蜱浓度的线性关系Fig.10　The linear relationship between the ΔA and the concentration of chlorpyrifos

可以看出，毒死蜱检测浓度和加入浓度较为一致，6次平行样品结果的平均回收率在94.2%到109.6%之间，说明构建的光比色传感器可以用于实际样品的检测。

表1　实际样品回收试验结果Table 1　Recovery studies of chlorpyrifos in vegetable（n=3）

3　结论

我们建立了一种能快速、灵敏的检测蔬菜中毒死蜱残留的纳米金比色分析方法。该方法基于有机磷农药能诱使镧功能化的纳米金由分散态（酒红色）向聚集态（蓝色）的转化。整个试验分析包括样品的处理只需15 min左右，检出限为1×10-10mol/L，该方法能安全、快速、现场实时检测蔬菜中的毒死蜱含量，不仅能肉眼进行定性检测，还可以借助分光光度计进行定量检测。

参考文献：

[1] 王晓飞,周启星.蔬菜中农药残留检测技术研究进展[J].生态科学,2004,23(4):356-361

[2]朱正斌.高效液相色谱法在农药残留分析中的应用[J].化学工业与工程技术,2004,25(6):51-53

[3]黄聪.键合固定相气相色谱法分离测定蔬菜中有机磷农药的残留量[J].分析科学学报,1999,15(4):321-323

[4]A Cappiello,G Famiglini,P Palma,et al.Trace level determination of organophosphorus pesticides in water with the new direct-electron ionization LC/MS interface[J].Anal Chem,2002,74(14): 3547-3554

[5]Love J C,Estroff L A,Kriebel J K,et al.Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology[J].Chemical Reviews,2005,105(4):1103-1170

[6]Turkevitch J,Stevenson P C.A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold[J].Discussions of the Faraday Society,1951,11(11):55-75

[7]Juewen Liu,Yi Lu.Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes[J].Nature protocols,2006,1(1):246-252

[8]Frens G.Preparation of gold dispersions of varying particle size: controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nature:PHys Sci,1973,241:20-22

[9]Li L,Li B.Sensitive and selective detection of cysteine using gold nanoparticles as colorimetric probes[J].Analyst,2009,134(7):1361-1365

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.031

收稿日期：2014-10-22

基金项目：山东检验检疫局科研项目（SK201357）

作者简介：贝峰（1971—），男（汉），高级工程师，硕士研究生，研究方向：食品安全分析。

Gold Nanoparticles-based Colorimetric Assay for Rapid Detection of Chlorpyrifos in Vegetable

BEI Feng1，NIE Mei1，AI Shi-yun2，ZHAO Cheng-xin1
（1.Tai'an Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tai'an 271000，Shandong，China；2.College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract：A gold nanoparticles-based colorimetric assay for rapid detection of chlorpyrifos in vegetable was developed.Based on the coordination effect of the oxygen-containing groups and lanthanum（III）functionalized gold nanoparticles，chlorpyrifos could induce the aggregation of lanthanum functionalized gold nanoparticles，thereby resulting in red-to-blue color change.So the concentration of chlorpyrifos could be determined by monitoring with the naked eye or a UV-vis spectrometer.The absorption difference of the assay exhibited a linear correlation to chlorpyrifos concentration in the range from 5×10-10mol/L to 5×10-7mol/L with a limit of detection of 0.1 nmol/L（S/N=3）.The merits（such as simplicity，low cost and visual colorimetry）make the proposed method for on-site screening of chlorpyrifos in vegetable.

Key words：gold nanoparticles；chlorpyrifos；colorimetry