慢性心衰患者血管内皮细胞体外损伤模型的研究

钟伟等

【摘要】目的 研究慢性心力衰竭患者血管内皮细胞体外损伤模型的建立办法。方法 收集心衰患者及健康人血清并干预人脐静脉内皮细胞，检测细胞活性OD值、循环内皮细胞（CEC）、血管假性血友病因子（vWF）、可溶性血栓调节蛋白（sTM）含量并做统计学分析。结果 心衰组CEC、vWF、sTM含量比正常组高（P<0.05）。结论 慢性心衰患者血清可损伤血管内皮细胞功能。

【关键词】慢性心衰；内皮细胞；模型

【中图分类号】R54 【文献标志码】A

构建科学、客观的实验模型对心衰发病机制及病理过程的研究及临床诊治具重要意义。本研究采用心衰患者的血清作用于体外培养的血管内皮细胞，构建血管内皮细胞损伤模型，并通过各项指标评价模型的科学性、客观性。

实验材料与方法

一般资料：心衰组30例，年龄62～75岁，男19例，女11例。正常组30例，年龄62～78岁，男17例，女13例。两组一般资料无差异（P>0.05）。

试剂与设备：胰蛋白酶、MTT（日本Sigma公司），标酶仪（美国biotek），胎牛血清（四季青研究所）、血管内假血友病因子（vWF）和血栓调节蛋白（sTM）酶联免疫定量检测（EHSA）试剂盒（美国ADL公司）。

方法：

血清制备：空腹采血5ml，静置后离心，取上清液制备成血清，恒温灭活后进行过滤除菌分装，-20℃保存。

致伤模型的建立：将对数生长期的人脐静脉分为2组（A组、B组）种入培养板，每组设30个复孔，用胎牛血清培养24h后，在A组加入15%心衰患者血清+85%DMEM的条件培养基进行损伤造模，在B组加入15%健康人血清+85%DMEM的条件培养基。培养24h后进行指标检测。

实验指标观察：①MTT法检测细胞活性 各组细胞每孔加入MTT，继续培养4h后每孔加入DMSO，自动酶标仪震荡后于490nm处测定吸光值。实验中设不加细胞只加培养液的孔为空白对照孔。比色时以空白对照孔调零。②循环内皮细胞数（CEC）的检测 等密度梯度离心法。将上清稀释后加入到密度Percoll液中离心，取界面以上液体作为上层，Percoll 层液体作为中层。上层液体离心后弃管中上清液，加生理盐水。中层震荡使细胞悬浮备检。上述液体滴于血细胞计数池中，观察内皮细胞数。③vWF和TM水平的检测 上清液离心后分离血清，-80℃冰箱保存。vWF 浓度测定采用lurell火箭电泳法，TM 浓度测定采用ELISA法。

统计学处理：数据以均数±标准差表示，两样本间均数比较用t检验，多组样本均数间比较用方差分析。数据处理用SPSS13.0软件处理。

结果

组别

注：与健康组比较，★P<0.05。

讨论

研究发现，血管内皮细胞（VEC）的损伤是多种心血管疾病的共同病理生理学基础[1]。CHF者心泵血量减少，外周循环血流量减少，组织缺血缺氧，释放出大量自由基和炎症细胞因子，导致VEC发生损伤和功能紊乱[2]。VEC损害主要以内皮依赖性舒缩反应平衡破坏为特征。因此，构建科学、客观的细胞损失模型是保护及改善VEC功能乃至治疗CHF至关重要的一步，为治疗CHF开辟了一条新的途径。本研究采用机体的血清作用于体外培养的血管内皮细胞，构建血管内皮细胞损伤模型，通过该模型对CHF患者和健康人群的CHF相关指标进行观察、比较和探讨。

评价VEC损伤程度的代表性指标有CEC、vWF和TM。CEC是目前在活体内唯一可以特异而直接地反映血管内皮损伤的指示物，其增高可反映VEC受损程度。血清vWF含量与VEC受损呈正相关关系，因此测定其在血清中浓度可反映血管内皮功能状态。TM在血管内皮细胞发生炎症等病理过程或损伤后被大量释放至循环血液中，敏感反映血管内皮尤其微血管病变损伤病变。本实验中可见心衰组吸光值低于健康组， CEC低于健康组，证实心衰患者血清中内皮细胞损伤脱落更明显；心衰组vWF指标和sTM高于健康组，其机制可能与心衰诱发血管内蛋白等有机物质发生复杂的化学反应、释放各种调节蛋白入血有关。

总之，本实验通过采用心衰患者血清体外致伤血管内皮细胞构造模型，具有客观、科学性，为进一步研究治疗心衰提供奠基作用。不足之处是本实验研究例数有限，可能会对结论的准确性有影响，需要在今后的试验中继续扩大样本量。

参考文献

[1] 单莎瑞.自体血管内皮祖细胞抗衰老作用的初步临床研究[D].广州：第二临床医学院，2010年.

[2] Koninckx R，Dani ls A，Windmolders S，et al.The cardiac atrial appendage stem cell： a new and promising candidate for myocardial repair[J].Cardiovasc Res，2013，（03）.