脐血移植患者T淋巴细胞内细胞因子的特性研究

杨会志，朱小玉，汪　健，孙自敏

脐血移植患者T淋巴细胞内细胞因子的特性研究

杨会志，朱小玉，汪健，孙自敏

摘要目的探讨异基因脐血移植后外周血T淋巴细胞免疫功能的特点及规律。方法11例异基因脐血移植患者分别在移植前、移植后30、60和90 d取外周血，将其中T淋巴细胞在莫能霉素存在的情况下，体外经十四烷酰拂波醇乙脂和离子霉素刺激后，分别进行CD4-FITC、CD8-FITC荧光单抗染色和γ-IFN-PE、IL-4-PE荧光单抗胞内染色，最后进行流式细胞仪分析。结果脐血移植后60 d的T淋巴细胞分泌γ-IFN和IL-4的比率开始增加，90 d后T淋巴细胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明显（P＜0．001）。结论脐血移植60 d后患者的免疫功能开始恢复，90 d后免疫功能达到顶峰，脐血移植是治疗急性白血病的一种有效方法。

关键词异基因脐血移植；T淋巴细胞；细胞因子

2015-06-29接收

自从法国Gluckman教授于1988年完成了世界首例异基因脐血移植后，世界各地相继运用该技术成功治疗血液系统恶性病、恶性实体瘤及遗传性疾病等多种疾病。脐血移植的安全性和有效性在临床实践中不断得到验证，与其他类型造血干细胞移植相比，人体脐血移植的移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）发生率较低且严重程度相对较弱［1］。但脐血移植患者造血重建和免疫恢复相对延迟，存在一定程度的免疫缺陷状态，这都使受者对各种微生物的易感性增加，易患致命性细菌、霉菌及病毒感染［2］，导致移植失败。因此研究脐血移植前后外周血T淋巴细胞免疫活性恢复情况非常重要。该研究利用流式细胞仪技术检测脐血移植患者移植前后T淋巴细胞胞内细胞因子的变化及其分布格局，探讨脐血移植后的免疫重建特性，了解可能的发生机制。

1　材料与方法

1．1病例资料选取安徽医科大学附属省立医院2013年1月～2014年7月11例异基因脐血移植患者，分别取患者移植前以及移植后30、60和90 d的外周血T淋巴细胞。采用环胞素＋骁悉预防GVHD；如发生GVHD，加用甲强龙干预，干预后可抑制过强的免疫功能。

1．2实验方法采用微量全血法采集标本，细胞因子检测所需试剂和仪器主要为流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞分泌的干扰素（interferon，IFN）和白介素（interleukin，IL）两种细胞因子。取0．5 m l经肝素抗凝的外周血加入0．5 ml IMDM完全培养基，5%CO2孵育5 h加红细胞裂解液5 000 r／min离心1 min，弃上清液备用。分别加抗CD4-FITC、CD8-FITC荧光单抗，4℃避光静置30 min，用染色缓冲液清洗，加质量浓度为1%PFA-PBG每管50μl，4℃过夜。再用穿孔缓冲液洗1次，每管加200μl穿孔液，室温静置20 min，5 000 r／min离心1 min弃去上清液。加荧光素标记的抗淋巴因子抗体：每管各加200 ng（5～10μl）标记物和等量穿孔缓冲液，室温孵育30 min，分别用穿孔缓冲液洗1次，染色缓冲液洗1次。用质量浓度为0．5%PFA-PBS，制备悬浮细胞，置与流式细胞仪上进行检测。根据检测获取的数据，用CBA软件自动绘制标准曲线，根据标准曲线自动计算出样本中各细胞因子含量。

1．3统计学处理使用SPSS 13．0进行统计学处理，计量资料描述用±s表示；对重复测量资料比较采用单因素重复测量方差分析，γ-IFN和IL-4的变化关系采用相关性分析。

2　结果

2.1异基因脐血移植后T淋巴细胞免疫系统重建特性T淋巴细胞分泌的γ-IFN和IL-4经流式细胞仪检测（图1），患者脐血移植前外周血中CD4＋T细胞和CD8＋T细胞胞内分泌的γ-IFN和IL-4比率分别为（3．97±0．98）、（3．62±0．79）和（2．81± 0．42）、（4．48±1．45）。相对于移植后30 d，移植后60、90 d的CD4＋T细胞和CD8＋T细胞胞内分泌的γ-IFN和IL-4均逐渐增高，Linear趋势检验结果显示差异均有统计学意义（P＜0．001）。

2.2γ-IFN和IL-4变化的相关性分析经相关分析，异基因脐血移植患者γ-IFN和IL-4变化呈正相关性（r＝0．789，P＜0．001）。见图2。

3　讨论

异基因造血干细胞移植是现今治愈血液病最安全有效的方法。由于人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）严格相合的血缘及非血缘骨髓供者严重不足而极大地限制了移植的广泛开展。而感染和免疫重建是影响移植疗效的另一个主要因素，感染相关的死亡大多发生于移植后3～4个月。故应密切监测免疫重建进程，并根据检测结果及时调整治疗方案，从而提高人体脐血移植的成功率。免疫重建过程中的细胞因子的检测方法较多，而流式细胞仪双标记法检测是目前国内外最经典方法，不仅可以准确地反映单一细胞分泌细胞因子的能力，而且又能反映具有分泌细胞因子能力的特定细胞群及细胞数量，是目前国际上常用的测定T淋巴细胞功能亚群、活化状态、分化情况的一种先进的方法［3］。

表1　脐血移植患者移植前后胞内　γ-IFN和　IL-4的变化情况（n＝11）

T淋巴细胞亚群繁多，功能各异，按其胞内分泌的细胞因子谱的不同至少可分为两种功能截然不同的亚群，即Th1和Th2。Th1亚群主要分泌IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ；Th2亚群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。在Th1亚群中以IFN-γ分泌为主要特征，参与细胞免疫反应，是引发GVHD的主要细胞亚群，在造成GVHD的“细胞因子风暴”中，Th1分泌的细胞因子起着关键作用。而Th2亚群中以IL-4的分泌最富代表性，主要参与体液免疫应答。Th1和Th2亚群之间还存在拮抗作用，分泌的细胞因子均可刺激自身的分化与发展而抑制对方的分化与发展［4-6］。

白血病患者因为本身免疫受损，功能低下，导致T淋巴细胞功能降低，本实验也表明，脐血移植前T淋巴细胞分泌的γ-IFN和IL-4较正常人弱［7］，显示白血病患者自身的T淋巴细胞免疫功能下降。移植后30 d，T淋巴细胞分泌γ-IFN和IL-4的比率较移植前继续下降，显示患者此时处于免疫功能缺乏状态。脐血移植后60 d后T淋巴细胞分泌γ-IFN 和IL-4的比率开始增加，显示T淋巴细胞免疫功能开始恢复，特别是Th2亚群细胞恢复较快。90 d后T淋巴细胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明显，本次研究显示，IFN-γ和IL-4的增加变化呈正相关性，提示Th1和Th2免疫功能同步恢复。但是γ-IFN的分泌量较IL-4的分泌量增加显著，显示一种优势明显的细胞因子分泌状态。由于90 d后T淋巴细胞的这种功能增加可能是GVHD发生的原因之一，这与本实验11例病例中有2例发生GVHD相吻合。本实验观察的病例数较少，结果可能有偏移，应加强相关病例数研究。

参考文献

［1］Grewal SS，Barker JN，Davies SM，etal．Unrelated donor hematopoietic cell transplantation：marrow or umbilical cord blood［J］．Blood，2003，101（11）：4233-44．

［2］Bowers E，TamakiS，Coward A，et al．Differing functional recovery of donor-derived immune cells after purified haploidentical and fullymismat ched hematopoietic stem cell transplantation in mice ［J］．Exp Hematol，2000，28（12）：1481-9．

［3］Boesch M，Zeimet A G，Reimer D，et al．The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics［J］．Oncotarget，2014，5（16）：7027-39．

［4］Nishioka C，Ikezoe T，Yang J，et al．The combination of IκB kinase βinhibitor and everolimusmodulates expression of interleukin-10 in human T-cell lymphotropic virus type-1-infected T cells［J］．Immunology，2013，138（3）：216-27．

［5］Liu J，He C，Zhou H，et al．Effects of TLR4 onβ2-glycoprotein I-induced bone marrow-derived dendritic cellsmaturation［J］．Cell Immunol，2014，290（2）：226-32．

［6］Hardtke-Wolenski M，Kraus L，Schmetz C，et al．Exchange of cytosolic content between T cells and tumor cells activates CD4 T cells and impedes cancer growth［J］．PLoSOne，2013，8（10）：e78558．

［7］杨会志，汪健，孙自敏．急性髓系白血病患者T淋巴细胞内细胞因子表达特性［J］．中国实验血液学杂志，2007，15（6）：1161-4．

The characteristics of T lymphocyte cytokine in the cord blood transp lantation patients

Yang Huizhi，Zhu Xiaoyu，Wang Jian，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo evaluate characteristics of T-lymphocyte immunologic function and reconstitution after allo-gene cord blood transplantation．MethodsTo peripheral blood from 11 human cord blood at30，60 and 90 days after cord blood transplantation，the T-lymphocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate and ionomycin in the presence ofmonensin．CD4＋and CD8＋Tcellswere analyzed forγ-IFN and IL-4 intrecellular production by flow cytometry．ResultsThe rate ofγ-IFN and IL-4 from T lymphocytes began to increase at60 days after the transplantation，and the rate ofγ-IFN and IL-4 increased significantly at90 days after the transplantation（P＜0．001）．ConclusionThe immune function begins to recover at 60 days after the Cord blood transplantation，the immune function peaks after 90 days．Cord blood transplantation is effective for the acute leukemia trerapy．

Key wordsallo-gene cord blood transplantation；T-lymphocytes；cytokines

中图分类号R 55

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1680-04

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：31101006）

作者单位：安徽医科大学附属省立医院血液科，合肥230001

作者简介：杨会志，男，副主任医师，责任作者，E-mail：yanghz69＠sina．com